大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性

1、大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性【关键词】骨髓基质干细胞;成骨细胞;共培养老年性骨质疏松是一种退行性病变，其病理根底是由破骨细胞引起的“骨吸收大于成骨细胞(B)引起的“骨形成。B来源于多潜能骨髓基质干细胞(Ss)，既往研究倾向于研究Ss向B分化，以及分化过程中的影响条件，对于B对Ss分化的影响的研究较少，因此，本研究设计并建立了Ss/B共培养模型，并观察B对Ss分化的影响。1材料与方法1.2方法1.2.1B的别离、扩增及鉴定取10只1日龄乳鼠颅盖骨,去除软组织,用PBS缓冲液屡次漂洗,快速剪碎,用11的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于37消化10in。以1200r/in，

2、离心5in,弃上清液,用含20%小牛血清培养液悬浮细胞并接种于培养瓶中,于37恒温、5%2及饱和湿度的细胞孵箱中培养。将骨组织块再用11的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于37消化20in,离心搜集细胞,并接种于培养瓶中,以上步骤重复2次。每23d更换培养液,待原代细胞长至80%瓶底面积时以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分24瓶的比例传代培养，进展扩增。倒置显微镜观察细胞形态，碱性磷酸酶(ALP)染色观察细胞分泌情况及矿化结节染色。1.2.2Ss的别离、扩增及鉴定大鼠处死后用75%乙醇浸泡10in。取股骨和胫骨，剔去肌肉组织后用PBS冲洗3次，剪开骨头两端，露出骨髓腔。

3、用DE培养液冲洗骨髓腔，反复2次。冲洗后的液体过200目不锈钢网筛后，按11的体积比加于淋巴细胞别离液上层以1200r/in离心20in，汲取液面交界处的单个核细胞。PBS悬浮细胞，以200r/in离心6in，反复2次。吸去上清液后用DE培养液悬浮细胞并调整细胞浓度为1105/。接种细胞于塑料培养瓶，每瓶加细胞悬液5l。接种72h后换液,此后每34d换液1次。待原代细胞长至80%瓶底面积时传代培养,以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分24瓶的比例传代培养,反复进展扩增。倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测D44、D34及D45。1.3共培养模型的建立与分组利用复合培养体系

4、将B和Ss培养在培养液以及其中的大分子蛋白可以互相交流而细胞间不互相接触的培养板内，其间的隔膜孔径为0.4。培养上室内接种B，培养下室内放置经处理的盖玻片并接种Ss。分共培养组、普通培养组2组，每组于同一培养板重复12孔。1.5统计学处理采用SPSS11.5软件进展t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1Ss的形态学观察原代初贴壁的Ss呈成纤维细胞外观，贴壁细胞逐渐呈现集落生长，原代培养45d，贴壁细胞开场增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，外表颗粒少。68d后，部分区域形成细胞团簇，细胞呈现成纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见13个核仁，胞质丰富、明晰。生长期细胞分裂相

5、多见，细胞突起互相联接。原代培养细胞密度为1105/l时，1012d长满瓶底。交融成片的细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状排列，细胞呈梭形或椭圆形等。传代细胞搁置24h迅速贴壁，伸展，细胞呈均匀生长，细胞形态更加单一，56d铺满瓶底(图1)。图1原代Ss形态学观察(40)2.2Ss外表抗原鉴定免疫组化检测结果显示细胞均一性较好,2代细胞均一性在90%以上,D34、D45表达为阴性,D44表达阳性。2.3B的形态学观察原代细胞培养1d后细胞贴壁展开，呈多角形，不规那么，胞核大而清楚，呈圆形或卵圆形，含12个核仁。培养57d时细胞半集合，78d时细胞80%集合，12d细胞重叠生长，15d细胞结节形成

6、，基质堆积，原代培养细胞连续培养至20d时出现不透光的钙化结节。生长期细胞分裂相多见，细胞突起互相连接。集合时呈铺路石状。2.4茜素红染色及Gris法行骨ALP染色结果茜素红染色矿化结节呈现酒红色，ALP染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。2.5效应指标检测结果普通培养组骨钙素含量及钙化结节计数分别为0.7590.064;6.604.14,共培养组分别为0.9500.017;29.6011.34。说明共培养组骨钙素表达量钙化结节计数显著高于普通培养组(P0.05，P0.01)。3讨论B来源于多潜能Ss，B功能活性的改变除了与B数量、B本身存活期有关外，前B数量与功能活性也起到重要作用。Ss具

7、有干细胞的共性，即具有自我复制和多向分化才能，在不同条件下可以分别分化为所有中胚层来源的组织，如B、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等13，目前已经成为最具优势的组织工程种子细胞。骨钙素是近年新发现的一种蛋白质4，它由成骨细胞合成。它是B基因转录和表达的产物，也是骨形成指标之一，在正常的骨形成过程里，B首先表达型骨胶原，以构成骨基质的主要成分，然后开场表达骨ALP，为矿化做准备，矿化开场后表达骨钙素，骨钙素的合成受维生素D调控。可见骨钙素是由B合成分泌的一种非胶原蛋白，特异性表示成骨活性，为骨形成的敏感指标，是反映骨转换率的特异性指标。共培养体系细胞裂解液中骨钙素表达明显高于单独培养组，这说明经过共育后Ss向成骨分化增强。本结果显示说明B对Ss增殖以及向成骨分化有较强的诱导作用。根据相关文献研究59，作者推断，共培养体系中钙化结节数增多，与B分泌骨形态发生蛋白(BP)有关。B可合成、贮存并释放BP，目前认为成骨细胞BP的含量可反映B的骨形成才能，BP可以诱导血管周围Ss分化为成骨或成软骨细胞，并进一步形成骨和软骨。内源性BP为一组分子量不同的复合物，其生物效应比克隆纯