青霉素G酰化酶的研究进展课件

1、青霉素G酰化酶的研究进展课件青霉素G酰化酶的研究进展课件 背景介绍青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,PGA,EC1)能够水解青霉素G(Penicillin G，PG)脱苯乙酰生成6-APA。青霉素是应用最广的-内酰胺类抗生素,由于青霉素滥用导致了抗性病原体产生, 利用新型半合成抗生素是克服这种抗性病原体产生的有效方法。大多数新型半合成抗生素由6-APA转化得到，而6-APA主要由天然氨苄青霉素经酶法或化学方法去酰基得到。酶法合成具有绝对专一性、避免造成环境污染、产物容易提纯等优点，是目前生产6-APA的主要方法。（杨志建等,2004;范超等,2011） 背

2、景介绍青霉素G酰化酶(Penicillin G acyPGA的简介PGA的来源 细菌PGA家族成员分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 菌。前者有大肠杆菌(Escherichia coli，Ec)、 嗜柠檬酸克吕沃尔 氏菌 (Kluyvera citrophila，Kc)、雷氏普罗威登斯菌 (Providencia rettgeri，Pr)、粪产碱杆菌 (Alcaligenes faecalis，Af)、无色杆菌 木糖氧化属 （Achromobacter xylosoxidans，Ax） 与假单胞菌属 (Pseudomonas sp. ，Ps)等。后者为巨大芽孢杆菌(Bacillus meg- ate

3、rium,Bm)与粘节杆菌(Arthrobacter viscosus,Av).(杨志建等,2004) PGA的简介PGA的来源 细菌PGA家族成员分为革兰氏阴PGA的简介PGA的结构 青霉素G酰化酶由，亚基通过氢键作用结合在一 起，单独的和亚基均不具有酶活性，只有两者以适当的形式 结合后才具有活性。PGA的亚基与青霉素G的侧链结合，决定 酶的底物专一性；亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。 (李宁等,2002) PGA的简介PGA的结构 青霉素G酰化酶由，亚基通过氢键AfPGA的简介粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) 是产碱杆菌属 (Alcaligenes) 细菌的模式

4、菌种,该菌在自然界分布很广,是土壤中最常见的 异养微生物之一。目前有些菌株已是应用于发酵生产青霉素 G酰化酶的重要基因工程菌。 (李美等,2009) AfPGA 是粪产碱杆菌来源的青霉素G 酰化酶，AfPGA基因 直到1994年(美国专利5695978)才被克隆，同源性比较结果 表明它处于进化过程的一个独立分支。 AfPGA的简介粪产碱杆菌(Alcaligenes faecAfPGA的特性AfPGA对底物具有更高亲和力，对青霉素G的Km值比 EcPGA 低，比BmPGA低三个数量级。而其 Kcat 值是所有PGA中最高 的，表现出很高的活性。 (Svedas V 等,1997)AfPGA是PG

5、A家族中唯一在一级结构中具有链内二硫键的成员， 酶的热稳定性和pH稳定性均很高。(Verhaert 等,1997)在手性分子识别能力上，AfPGA比EcPGA具有更高的选择性。AfPGA在有机溶剂中表现出很高的稳定性，在双水相，催化抗 生素母核氨基和苯乙酰胺缩合时，其催化效率比EcPGA高出一 个数量级。(vall Langen等, 2000)AfPGA的特性AfPGA对底物具有更高亲和力，对青霉素G的PGA的应用welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience在半合成抗生素中间

6、体制备中的应用 青霉素酰化酶可以 催化水解反应制备半合成抗生素中间体6 -APA和7- ACA。 在外消旋混合物的拆分中的应用 青霉素酰化酶对苯乙酰 胺基团有立体选择性, 可用于胺和醇的拆分。拆分得到的 单一对映体可用作合成生物活性化合物的中间体。在半合成内酰胺抗生素合成中的应用 具体是利用青霉 素酰化酶催化酰基侧链和内酰胺核发生缩合反应生产半 合成青霉素和头孢菌素。在肽合成中的应用 利用青霉素酰化酶可以催化直接的酶 合成反应和酰基转移反应来合成肽及其衍生物。 (崔鹏等,2005;杨志 建等,2004;李震等,2008)PGA的应用welcome to use these PowPGA目前的研

7、究内容其他性质的 应用研究生产菌种的 选育和改造发酵生 产工艺酶法生产 6- APA的 下游工程主要内容大规模 提纯酶固定化PGA目前的研究内容其他性质的生产菌种的 发酵生酶法生产主PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experiencePGA产生菌改造由于野生型微生物产生的青霉素酰化酶量较少,且酶活 较低,故当前许多研究者从基因水平上优化宿主细胞, 旨在提高野生型菌种的产酶能力和酶活力,减少-内 酰胺酶的产生以及弱化或消除不利于青霉素酰化酶工 业化应用的

8、因素。对青霉素酰化酶产生菌进行菌种改造的手段有物理或 化学诱变、定点突变和利用基因工程改良菌种。PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to usePGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experiencePGA产生菌改造Zhou Z等构建的工程菌B. subtilis (pMAPGA)和B. subtilis (pBAPGA)实现了AfPGA 的胞外分泌表达。分泌表达的最 高表达量为653u/L，比野生型A.faecalis表达量高109倍。 (Z

9、hou等,2002)杨志建等将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达 质粒pKKFPGA ,pKKFPGA 再转化到宿主菌DH5,所得重组 菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶,表达量2590u/L 比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍,其菌体比活力达300 u/L。（杨志建等，2004）PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to usePGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience发酵条件的优化 Pinotti 等对B.megater

10、ium ATCC14945的培养条件 进行研究, 结果表明氮源与酶产量之间有较密切的 联系,并且葡萄糖对产酶有抑制作用,用水解后的酪 蛋白和奶酪乳清作氮源，酶浓度达最大值138IU/L。 (Pinotti等,2000)PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to usePGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience发酵条件的优化史敏龙等对表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的重组枯草 杆菌WB600(pMA5)进行发酵研究。实验表明,发酵液中 的

11、葡萄糖浓度和菌体产酶能力密切相关, 维持低葡萄糖 水平,可以提高枯草杆菌WB600(pMA5)青霉素G酰化酶 的合成能力。(史敏龙等，2003)PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to usePGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience发酵条件的优化范超等采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法, 对重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶的发酵条件进 行优化,得出其最佳发酵条件为: 葡萄糖32 g/L、胰 蛋白胨17 g/L、时

12、间42.5 h、温度34,在此条件下 青霉素G酰化酶的活力达到10 6148 U/L,较优化前 提高了16.83%。(范超等,2011)PGA产生菌改造与发酵条件的优化welcome to usePGA的分离提取welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience超声破碎法特点 酶活力回收率高,需要多步纯化。 (孙健等,2006)原理 本法是利用钛探头的振动在细胞悬液中产生出 共振腔, 共振腔的坍塌引起压力变化,产生剪切力破碎 细胞。利用大肠杆菌作为基因工程菌, 多采用超声波 法提取

13、。PGA的分离提取welcome to use these PPGA的分离提取welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience渗透压法特点 酶比活力高,酶活力较超声波法低。(张贺迎等,2000)原理 本法是利用高渗及低渗溶液在细胞内外造成渗 透压差，低渗溶液中的水渗入细胞导致细胞破裂。提 取细胞壁较脆弱的G-菌的胞内酶，渗透压冲击法是一 种快速得到高比活粗酶液的有效方法。PGA的分离提取welcome to use these PPGA的分离提取welcome to use th

14、ese PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience有机溶剂法特点 酶比活较高,酶容易失活。(Alves等,2003)原理 本法是利用有机溶剂溶解细菌细胞内膜的脂肪, 从而释放酶。不同浓度的有机溶剂对细胞内膜的作用 不同,释放出不同量的酶。PGA的分离提取welcome to use these PPGA的分离提取welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience反胶束溶液提取法特点 酶回收率比超声波处理

15、方法高，而且酶的比活 较高。(Alves等,2003)原理 反胶束技术被用来提取分子量从6KD到100KD 的许多蛋白质和酶,对它们活力的损害很小。二(2 乙基已基)硫代琥珀酸钠(AOT)稳定的水已烷粗乳状 液和细乳状液可选择性地改变大肠杆菌细胞通透性， 用于提取青霉素酰化酶。PGA的分离提取welcome to use these PPGA的纯化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 杨志建等用DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换层析和Butyl- Se

16、pharose CL-4B 疏水层析纯化菌体破碎后的上清液，可得 纯度提高20 倍、比活为 6816 u/mg 的青霉素G酰化酶, 两步 纯化的总收率达91 %.(杨志建等，2004) Zhou Z 等发酵所得的青霉素G酰化酶经硫酸铵分级沉淀和 DEAE-Sepharose CL-6B 两步纯化, 纯度提高86 倍, 活力回 收率达到81 %,纯化后的PGA 活力为1. 469 u/ mg.(Zhou 等,2002) PGA的纯化welcome to use these PowPGA的固定化welcome to use these PowerPoint templates, New Conte

17、nt design, 10 years experience青霉素酰化酶的固定化采用固定化细胞或固定化酶2种 形式。其方法包括吸附、包埋、微胶囊化、离子交换、 交联、共价连接等。(张业旺等，2008)颜淑玮等研究了AfPGA在商品化环氧载体上Eupergit CM 上的固定化及后修饰，得到固定化酶表观酶活为177U/g, 固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了操作稳定性及热稳定 性。(颜淑玮等，2006) PGA的固定化welcome to use these PoPGA的固定化welcome to use these PowerPoint templates, New Content design,

18、 10 years experience目前已有很多方法将含PGA的大肠杆菌 E.coli 菌株及突 变菌种的细胞进行固定化，如包裹在聚甲基丙烯酸酰胺 细胞内部，或者包裹在凝胶基质中。所得的固定化酶能 够有效地水解青霉素G,水解效果优于自由酶。 (Hsiau等,1997;Norouzian等,2002)PGA的固定化welcome to use these Po存在的问题welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience野生型菌种产酶量和酶活力均比较低。大多数微生物来源的PGA为胞

19、内酶，提取困难。 存在的问题welcome to use these Powe 青霉素酰化酶在半合成抗生素生产中起着很重要的作用，其中PGA是在工业生产中应用最多的，随着酶技术的不断发展，PGA在固定化技术、非水相介质酶催化 技术及定点突变技术等方面取得了一定的发展，而且研究者不断采用基因工程方法筛选高产PGA的优质菌株。PGA在基因工程和酶工程方面的不断发展，将使其在医药、食品、中间体合成等领域的应用逐步扩大。小结 青霉素酰化酶在半合成抗生素生产中起着很重要的参考文献1杨志建,蔡谨,孙健等.粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化 J.生物工程学报,2004,20(5):73

20、6740.2黄艳红,袁中一,王应睐.巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯 化J.中国生物化学与分子生物学报,1999,15(1):169478.3李宁,宗敏华,彭华松等.青霉素酰化酶的研究进展J.生命化学,2002,22(4):301 303.4崔鹏,万敏.青霉素酰化酶的生产与应用新进展J.化学工业与工程技术,2005,26(6): 42-45.5Verhaert R M D, Riemens A M, vanderlaan J M, et a1.Molecular cloning and analysis of the gone encoding the thermostab

21、le penicillin G acylase from Alcaligenes faecalisJ.Applied and Environmental Microbiology,1997,63(9): 34123418.6vall Langen L M, Oosthoek N H P, Guranda D T, et a1. Penicillin acylase catalyzed resolution of amines in aqueous organic solventsJ.Tetrahedron Asymmetry,2000,ll(22):45934600.7范超,黎继烈,吴浩等.重

22、组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶发酵条件研究J.中南林业 科技大学学报,2011,31(7):124130.8Pinotti L M, Silva F S, et al.Study of different media for production of penicillin G acylase from bacillus megaterium ATCC14945J. Biochemistry and Biotechnology,2000,84:655-663.9Norouzian D, Javadpour S, Moazami N,et al.Immobilization of whole c

23、ell penicillin G acylase in open pore gelatin matrixJ.Enzyme Microb Technol, 2002,30:2629.参考文献1杨志建,蔡谨,孙健等.粪产碱杆菌青霉素G酰化酶参考文献10 Verhaert R M D, Riemens A M, vanderlaan J M, et a1.Molecular cloning and analysis of the gone encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalisJ. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(9):34123418.11王祯祥,徐冠珠,朱丽钊等.微生物发酵法生产青霉素酰化酶P.CN 89108207.7,1991 12史敏龙,叶勤.粪产碱杆菌青霉素酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达优化J.华东理工大 学学报,2003,29(6):575-578.13Rodrig