《生物化学》 核酸的研究方法

1、第四单元 核酸化学第十二章 核酸通论第十三章 核酸的结构 第十四章 核酸的理化性质第十五章 核酸的研究方法小 结第15章 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应(PCR) 六、DNA的化学合成 一、核酸的分离、提纯和定量测定(一)DNA的分离和纯化(二)RNA的分离与纯化(三)核酸的鉴定(一)DNA的分离和纯化 真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（DNP）形式存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但不溶于生理盐溶液(0.14mol/L氯化钠）,利用这一性

2、质，可将细胞破碎后，用浓盐提取后加水稀释至0.14mol/L盐溶液，使DNP纤维沉淀。 用苯酚抽提，除去蛋白质。 苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP一起震荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。(二)RNA的分离与纯化RNA比DNA更不稳定，而且RNase无处不在，因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3 点： 一、制备的玻璃器皿要经过高温焙烤，塑料用具要高压灭菌。二、在破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase失活。三、在RNA的反应体系内加入Rnase的抑制剂。(三)核酸的鉴定 核酸纯度的鉴定可以通过测定样品在2

3、60nm和280nm的光吸收比值来确定，进一步鉴定可用凝胶电泳等方法。核酸含量的测定一般是通过测定磷含量、核糖含量或紫外吸收等方法来确定。 根据元素分析，每11g核酸约含有1g磷，即每测得1g磷就相当于含有11g核酸。(RNA含磷量约为8.5%9.0%，DNA含磷量约为9.2%)。 定磷法是用浓硫酸将核酸中的有机磷消化为无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂显色，通过比色法测定磷含量，从而求出核酸含量。1.定磷法 RNA中核糖用苔黑酚法测定，DNA中脱氧核糖用二苯胺法测定。 苔黑酚反应：D-核糖与浓HCl和甲基间苯二酚混合后，加热呈绿色。(因为核糖与酸作用产生糠醛，糠醛与甲基间苯二酚和FeCl3作用呈绿

4、色)。 二苯胺反应：D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热呈蓝色。(因为D-2-脱氧核糖与酸作用产生-羟基-酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色)。2.定糖法 常用OD260/OD280的比值来判定核酸样品的纯度。 对于纯样品: 1个OD260值相当于50ug/ml 双螺旋 DNA， 或40ug/ml单链DNA(或RNA)， 或20ug/ml寡核苷酸。 (详见P507核酸的紫外吸收) 3.紫外吸收法光 吸 收220240260280nm0.10.20.30.4123DNA的紫外吸收光谱天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值波长二、核酸的超速离心 核酸与蛋白质及其它杂质各有不同的沉降系数（S），可以用超速离

5、心的方法使核酸和其它杂质分开。也可以用此法将不同种核酸进行分离。RNA分离常用蔗糖密度梯度超离心，DNA分离常用氯化铯密度梯度超离心。 (见P294-295沉降法测相对分子量，S=110-13秒) 例如应用啡啶嗅红氯化铯密度梯度超离心： 石蜡油蛋白质开环及线形DNA闭环质粒DNARNA、超螺旋DNA如图所示 RNA、超螺旋DNA在管底 闭环质粒DNA在第二层 开环或线形DNA在第三层 蛋白质出现在第四层。三、核酸的凝胶电泳 凝胶电泳是核酸研究中最为常用的方法之一。凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应双重效果，所以分离效应很高。 核酸分析中常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝

6、胶孔径较大，常用于分析DNA；聚丙烯酰胺凝胶孔径较小，常用于分析RNA或片段较小的DNA。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳图谱凝胶成像及分析系统四、核酸的核苷酸序列测定1977年Sanger、Maxam及Gilbert分别建立了两种较完善而快速的测定DNA序列的方法,下面做分别介绍。 (1)化学断裂法 (2)末端终止法(又名双脱氧法)(1)化学断裂法由Maxam和Gilbert于1977年创立。用一种多核苷酸激酶将含32P的磷酸接在待测DNA片段的5 -OH端。5 -末端标记上32P的DNA片段在适当的试剂及条件下在特定的碱基位置断裂。MaxamGilbert 根据对测序DNA断裂的碱基位置不同，

7、可分为四组： G组 表示DNA链在G位断裂， G+A组 表示DNA在G位和A位都可断裂 T+C组 表示DNA在T位和C位都可断裂 C组 表示DNA在C位断裂。 G组: 用硫酸二甲酯使嘌呤环上的N7甲基化 G+A组: 用甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化 T+C组: 用肼使T和C的嘧啶环断裂用哌啶除去碱基 C组: 当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去 将上述四种处理所得核苷酸片段进行凝胶电泳及放射自显影，将G道与G+A道的条带作比较，即可知道DNA片段中何处是A及G的断裂点。同理，将C道和T+C道的条带作比较，可推知DNA片段中T和C 的断裂点。再将G、G+A、T+C及C四道中的条带作综合比较

8、，就可以将DNA分子中的核苷酸序列测定出来。如待测DNA片段：5-32P-GCTACGTA-3在 特异切断后，可得如下带有32P的各种片段。 在A处切断：32P-GCT 32P-GCTACGT在G处切断：32P-GCTAC在C处切断：32P-G 32P-GCTA在T处切断：32P-GC 32P-GCTACG则所测得的序列为： CTACGTA进行凝胶电泳，最短的片段跑在最前面 经过放射自显影可得：（2）末端终止法(又名双脱氧法) DNA合成时，需要提供下列条件： 1. 单链模板DNA 2. DNA聚合酶 3. 与模板3端互补的引物 4. 四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP

9、) （2）末端终止法(又名双脱氧法) 该方法是在酶法测序技术基础上进行了改进，以2，3-双脱氧核苷三磷酸作为核苷酸链合成的抑制剂.2，3-双脱氧核苷三磷酸（2）末端终止法(又名双脱氧法)反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有： 1. 待测的DNA单链片段，作为模板。 2. DNA聚合酶(如DNA聚合酶I)。 3. 序列已知且与模板3端互补的引物。 4. 四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP) 。 5. 四种双脱氧核苷酸中的一种，作为DNA链合成的末端 终止剂。 在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链3 端的-OH连接，而2 ，3 -双脱氧核苷三磷

10、酸核糖基的2 ，3 位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性： （2）末端终止法(又名双脱氧法) 一种可能是dNTP掺入新生链，使链继续延伸。 一种可能是2 ，3 -ddNTP掺入，使新生链的合成终止。由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。最后通过A、T、G和C四组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。 （2）末端终止法(又名双脱氧法)（2）末端终止法(又名双脱氧法)五、DNA聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一项 体外扩增DNA的生物技

11、术，已在全球广泛应用，其基本步骤是：1、设计一对DNA扩增所需要的引物2、优化反应体系 包括适量的模板、引物、4种dNTP、TaqDNA聚合酶和适量Mg2+。3、选择3个温度进行热循环： 变性温度（94oC）；退火温度（待定oC）；延伸温度（72oC）4、检测结果 最普通的方法是进行凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外光下检测结 果。PCRPCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5CPCR 循环 第一步 加热变性靶序列靶序列PCR 循环- 第二步 引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533靶序列靶序列Primer 1Primer 2

12、BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerasePCR 循环 - 第三步 - 引物延伸 第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列靶序列 靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6

13、cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconDNA 聚合酶-Taq酶 Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。 Taq酶的发现对于PCR技术的应用具有里程碑的意义。PCR循环包括变性（90C左右）、退火（50C左右）、延伸（70C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。（PCR动画） 第12章 核酸通论一、核酸的发现和研究简史二、核酸的种类和分布