《生物化学》核酸的物理化学性质

1、第四单元 核酸化学第十二章 核酸通论第十三章 核酸的结构 第十四章 核酸的理化性质第十五章 核酸的研究方法第14章 核酸的物理化学性质一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交一、核酸的水解 (一)酸水解 (二)碱水解 (三)酶水解 (一) 酸水解 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解。嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不稳定。对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键。 OO P O OO碱基糖CH2535 OO P O OO碱基糖CH2OH3- 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱糖苷键对酸更不稳

2、定 对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键嘌呤或嘧啶（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸，DNA的磷酸酯键则不易被碱水解，因为：RNA的核糖上有2OH基，在碱的作用下形成磷酸三酯（见P502结构式）。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷-2，3环磷酸，继续水解成为2 -核苷酸和3 -核苷酸。DNA的脱氧核糖无2OH基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定的抗性。 RNA水解后生成一个2 ，3环式单核苷酸中间体；中间体不稳定，很快转变为2单核苷酸和3单核苷酸RNA链碱水解2 -核苷酸3 -核苷酸（三）酶水解 水解核酸的酶种类很多。 非特异性水解磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯酶（p

3、hosphdiesterase），例如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。 专一水解磷酸二酯键的的酶称核酸酶（nuclease）。 见P503 图示。核酸酶的分类：1、按底物专一性分类: 作用于核糖核酸的称为核糖核酸酶(ribonuclease,RNase);作用于脱氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease,DNase.2、按对底物作用的方式可分为： 核酸内切酶(endonuclease)与核酸外切酶(exonuclease)。3、按磷酸二酯键断裂的方式可分为两类，一种在3 -OH与磷酸基之间断裂，另一种在5 -OH与磷酸基之间断裂。4、其他分类标准核糖核酸酶类（1）牛胰

4、核糖核酸酶(pancreatic ribonuclease) （EC 2.7.7.16）简称Rnase 3535P3535PACUGPP 只作用于RNA,不作用于DNA。 具有极高的专一性，其作用点为嘧啶核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为3-嘧啶核苷酸或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。（2）核糖核酸酶T1(ribonucleaseT1) (EC3.1.4.8) 具有比Rnase更高的专一性，其作用点是3 -鸟苷酸与其相邻核苷酸的5 -OH的连键，产物为以3 -鸟苷酸为末端的寡核苷酸，或3 -鸟苷酸。（3）核糖核酸酶T2(Rnase T2) 主要作用点为Ap残基，可以将tRNA完全降解

5、成3 -腺苷酸结尾的寡核苷酸。3535P3535PAGUCPP3535P3535PACUGPP脱氧核糖核酸酶类 （1）牛胰脱氧核糖核酸酶（EC 3.1.4.5） (pancreatic deoxyribonuclease, DNase) 此酶切断双链DNA或单链DNA成为以5 -磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为4个核苷酸，需镁离子（或Mn2+,Co2+）最适pH7-8。用 0.01mol/L柠檬酸盐可完全抑制被镁离子激活的活性。（2）牛脾脱氧核糖核酸酶（EC 3.1.4.6） (spleen deoxyribonuclease, Dnase)此酶降解DNA成为3 -磷酸末端的寡聚核苷酸，平均

6、长度为6核苷酸。最适pH4-5，需0.3mol/L钠离子激活，镁离子可抑制此酶。（3）链球菌脱氧核糖核酸酶 (streptococcal deoxyribonuclease, Dnase） 是内切酶，作用于DNA，成为5 -磷酸为末端的寡聚核苷酸，长度不一，最适pH7，需镁离子。 （4）限制性内切酶 在细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的DNA ，具有很严格的碱基序列专一性。如EcoR，不需要ATP，只需要镁离子，专一性很强，能识别DNA上6对碱基组成的序列，交错切割，形成的产物具有粘性末端。 二、核酸的酸碱性质 1、碱基的解离 2、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离

7、3、核苷酸的解离 4、核苷酸的滴定曲线（如图所示）1、碱基的解离 碱基具有芳香环结构特点: 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 主要是环内氨基的贡献: 嘧啶碱基N1可接受质子，C2的烯醇式羟基可给出质子； 嘌呤碱基N1可接受质子， N9可给出质子；（Ade、Gua、Cyt有氨基； Ura、Thy无氨基，不形成两性解离） 胞嘧啶: 尿嘧啶及胸腺嘧啶:酮式/烯醇式互变氨式/亚氨式互变鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上3、核苷酸的解离： 由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为两性电解质，在不同的pH溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能

8、发生解离，核酸的酸碱性质与此有关。 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性。三、核酸的紫外吸收 核酸中的嘌呤和嘧啶环的共轭体系强烈吸收260-290nm波段紫外光，其最高的吸收接近260nm。由于蛋白质在这一光区仅有很弱的吸收，因此可以利用核酸的这一光学特性来定位测定它在细胞和组织中的分布。 纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯RNA应达到2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚， A260/A280比值既明显降低。吸 收 峰220240260280nm0.10.20.30.4123DNA的紫外吸收光谱天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值波长四、核酸的变性、复性及杂交 (一)变性 (二)复性 (三)核酸的

9、杂交（一）核酸的变性1、变性的概念 2、热变性和Tm3、影响Tm的因素变性的概念 核酸变性（denaturation）指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化，不涉及共价键的断裂。磷酸二酯键的断裂称核酸降解。 核酸变性后，260nm的紫外吸收值明显增加，称增色效应。同时黏度下降，浮力密度升高，生物学功能部分或全部丧失，这些性质可用于判断核酸的变性程度。热变性和Tm（P508) 加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度后，260nm的吸光度骤然增加，表明两链开始分开，吸光度增加约40%后，变化趋于平坦，说明两链已完全分开。这表明DNA变性是个突变过程，类似结

10、晶的熔解，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称DNA的熔点或熔解温度（melting temperature）用Tm 表示。熔解温度曲线DNA的熔解温度影响Tm的因素 （1）DNA的均一性:均质DNA熔解过程发生在一个较小的温度范围内，异质DNA熔解过程发生在一个较宽的温度范围内，所以Tm可以作为衡量DNA样品均一性的标准。 （2）G-C对含量:G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，Tm愈高。 经验公式为: X G+C =( Tm 69.3)2.44 可利用该公式计算Tm值。( Tm在70110之间变化） （3）介质中的离子强度:离子强度较低的介质中，

11、Tm 较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。G+C含量Tm60708090100020406080100Tm值与G-C含量的关系(二) 核酸的复性复性的概念：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性（reassociation）。变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火(annealing)。 影响复性速度的因素 单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。 片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。 维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。 （三）核酸的杂交 在退火条件下，不同来源

12、的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交(hybridization)。 杂交可以发生于 DNA 与 DNA 之间，也可以发生 于 RNA 与 RNA之间和 DNA 与 RNA 之间。 探针(probe) ：生物化学和分子生物学实验中用于指示特定物质(如核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记分子。 探针技术是在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和 诊断的非常有用的技术，已在遗传性疾病诊断上开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。 1975年,由英国人埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建了印迹杂交技术（Southern blotting），又称印迹转移。Southern印迹杂交（Southern b