高产绒量转基因绒山羊新品种培育任务进展

1、高产绒量转基因绒山羊新品种培育任务进展报告内容研究进展绒山羊绒毛生长相关基因FGF-5转基因克隆山羊已获成果预计开展的工作承担任务转FGF-5基因高产绒量绒山羊品种的培育 2高产绒量转基因绒山羊新品种培育 内蒙古农业大学承担任务与绒山羊产绒量相关的FGF-5基因毛囊特异表达载体的构建以及转基因细胞系的建立。生产转FGF-5基因的克隆胚胎100枚。培育高产绒量转基因绒山羊5-10只。筛选出2-3个未知的与产绒量相关的功能基因。转基因载体构建和转基因检测研究进展一、绒山羊绒毛生长相关基因的获得与筛选（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库（二）应

2、用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因（三）绒山羊出生2周羊羔皮肤和70天胎儿皮肤差异表达基因的筛选（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库 SSH消减杂交兴盛期毛囊和休止期毛囊cDNA片段互为Tester和Driver，两轮消减杂交后，得到差异表达基因片段1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 255000bp3000bp 2000bp1200kb 800bp 500bp250bp1-12.反库PCR检测结果；13-24.正库PCR

3、检测结果；25.MarkerIII蓝色：约20%克隆质粒中无插入片段随机挑取正反库单克隆各12个，以T7或SP6为引物，经PCR扩增，约80%白色克隆质粒中有插入片段，多数插入片段长度在0.3-1kb，表明文库构建成功2.差异表达基因cDNA片段的T/A克隆及鉴定 3. 序列测定及结果分析正向消减文库反向消减文库有效序列(条)313355平均长度(bp)693596Contig数73110有效序列信息 注：正反向SSH文库各随机挑取750个克隆进行测序 视大于100bp的合格高质量序列为有效序列经生物信息学分析，发现与山羊类同源的序列较少，正向SSH消减文库309条序列中，山羊只有57条；反向

4、消减文库344条中，山羊的有35条。因此，所获得的数据，极大丰富了山羊的数据资源。4. 序列注释结果的功能分类 ForwardSSH(224) Reverse-SSH(300) Cell division1513Cell signaling/communication4449Cell structure/motility3052Cell/organism defense1321Metabolism2446Gene/protein expression3337Unclassified6582共向GenBank注册非冗余ESTs 126条，序列号为6497002564970150。对已知功能基因的

5、ESTs进行分类，（二）应用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因在消减文库的基础上，进行了两次荧光交换的cDNA芯片杂交，以筛选差异表达基因，芯片杂交结果见下表生长期休止期差异基因6个10个上调基因 3个9个下调基因3个1个注：主要试剂为晶芯系列产品生长期次级毛囊的差异表达基因 CloneLength(bp)E-valueEST nameUp-regulated GenesZ3F11463 0.00E+00Bos taurus sortilin-related receptor containing LDLR class A repeats preproprotein

6、(SORL1)Z5D6596e-104Homo sapiens mRNA for fibroblast growth factor receptor substrate 2Z80509未匹配Down-regulated GenesZ5H12251e-111Bos taurus sprouty homolog 2 (Drosophila) (SPRY2)Z1C105859.00E-56Pongo abelii, member RAS oncogene family (RAB11A)Z42199未匹配 发现6个次级毛囊生长期的差异基因： 上调基因3个：Sortilin、成纤维细胞生长因子受体底物及

7、未知基因1个； 下调基因3个： SPRY2 、 Ras癌基因家族成员RAB11A及未知基因1个。生长期未匹配 2个Z80TGAGAGCTTTAAAATTCCTGCAATGGTGCAAATTTTCTTAATTGAAAAATAATAAAATAAGGAGGAAAAAAAATCTAAATTTAGTCCTGCACTGAAATCCTCACCTTTGAAAAACTCTCAAGATAAAGATTTAGTAGAAACCCCATTCTCCATCATACTCTGGCTGATAAAGAAAACACAGCCACGCAAACAATAATTTAACACGAGCCAAAACAAAAGTGTTTTCAGAAAGAAGCTAGT

8、GTTGGCGATTTAAAGGTTTCCACTATGTCTGAGCATCTCCAATACAAATACCTTATGTATTTAAGGGAAGCTTCACAAGTCAAAAGCAATTTCACATAAATGATTCAATTCTTACCGTAAGCCCGTGACTTAAGCAGGGTAGGGATTATCTGCCTGGATTTGAGACATTACCAACCCAGTAAAAACGGGGATAAAAGACTGGCTATAAAAATGTAGCACTTCGTTTCCAAAAAAAAAAAGTATTCTTACTAAAACAACAAAATGGCCCGZ42CTTGAGTTAGTAGGAGCTTTTACATGTG

9、GTAAAAGGCTATTACTTAAACTCCATGAATTAAGGTAATTCTAACATTCTCCATTTTATGGCTCTAGCACCAAAGACCCAAAGCAGTGATACTGCATTGAACCATCCTTAGATTGCAGGCCCACTCTGGAGGCCAAGGTCCTAGGTGTTTTGTTGAAGGCTGTGTGTAAGT休止期次级毛囊的差异表达基因 CloneLength(bp)E-valueEST nameUp-regulated GenesF6H32756.00E-43Bos taurus zinc finger CCCH-type containing 18 (ZC3

10、H18)F15850e-139Bos taurus zinc finger protein ZNF33BF6A6683e-162Bos taurus type 2 desmocollinF4H12422.00E-95Bos taurus mortality factor 4 like 1 (MORF4L1)F1B16410.00E+00Bos taurus basic FGF-repressed Zic binding proteinF2E10366e-173Bos taurus , member RAS oncogene family (RAB18)F1C12560e-125Bos taur

11、us osteonectin (SPARC)F88494未匹配F59551未匹配Down-regulated GeneF4H10987e-140Bos taurus S100 calcium binding protein休止期未匹配 2个F59TTTTTCTCCCTAAAAAAAAAGAATTTTTTTTTTTGTTTTTTTCTAAAAAATGAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCGCCGGGGGGGGGGGGGAAAACTAAAAATATCGGGGGGGGGGGGACCCAAGGGAAAATAGGGTGGGTGCCAAAACCCACCCCCCCCCGGCACCCGAAAAAACCCA

12、AAAAAAAGACCCCCCCCCCCCCTTCTTATGCCACCACCCCCCCCCCTGAAAAAAACAACCACCCATAAAAAAAAACACAACAAATACTCTCCGCCGGGTTGTTTTCAGGGAGCCGGCAAAAAAAAAAACAACAAAACTGCCCAAAAAATCCCTAACCAAACGACAACCCCCAACAATAAAAAGAAACAACCCCCCCCCCGCAGGCACCGCTCATGAAATAAAGTTCCCCAACACAAAAAAGGGGGGGGGGTTTTCCGCCCCCCCCCCACACCATCAAATATAATTGCCCCCCCCCCCCAG

13、GCGATAAAGGGGGAGAAACCCCCCCCCCCGGCGGGGGGGGACGGTTTTTTTTCTTTTTTTTGGGGGCCCCCCCAF88TACCCGCCCCGTCACAACGCCGAGATCATTATGGAGCTCCCGCGGGTGCTGGCTAACAGTTCCCCAATTCCTCCCTTCATTATCTTTCTTCCTGTTTCTCTTGATATTGAGGTGGTACATGAAAGGGAGGCAAGGGAAGGGAAAGGGATATGTGCATGGGATGGGATAAAGAAATTTTGCCTAGAAGTAACAAACTTTCATCGTTATAAAATTTGGTTCTCCT

14、TGTTGAGTTTAAACAAAATGACTAATTGTTGTATTTTCTATCCAATCTCTAGCTGCACCATTTTAGACTCAATCCAGCCCGCACAACCCCGAGATGTCACTATTTCCGCCTCCTGTAGGACGACGATATGGGAGGGCCCGCCGCTCGTCGTATGAATAGCATGCCCATTCCAGTCTTCCTACCAAACCCTTGCCTTACCATGGAAGCCATCCTTTCCAGAGTTGGTTGTTATCCGCTCACTTTCCGGACTTCTTCCCACCCCCTTTTTGGA 发现10个次级毛囊休止期的差异基因： 上调基因9个：锌指

15、蛋白ZC3H18及ZNF33B、II型桥粒糖蛋白、MORF4L1、Zic结合蛋白、Ras癌基因家族成员RAB18、SPARC、未知基因2个； 下调基因1个：S100钙连接蛋白。（三）绒山羊出生2周羊羔皮肤和70天胎儿皮肤差异表达基因的筛选与70天胎儿皮肤相比，出生2周羊羔皮肤组织中表达上调大于2倍的基因共有1370个；表达下调大于2倍的基因共有1127个。这些差异表达的基因参与细胞内的代谢、转录调控、应激/免疫反应、结构组成等。 应用Affmetrix公司牛基因组芯片与SSH结合筛选差异表达基因其中与毛囊发育生长有关的重要基因有: SOX2、SOX9和SOX18 BMP-2和BMP-4 FK5

16、06SOX基因家族编码转录因子，在动物发育过程中发挥重要的作用。SOX家族的3个成员SOX2、SOX9和SOX18出现在差异表达的基因中。在羊羔皮肤中上调的有SOX9，在胎儿中上调的有SOX2、SOX18。SOX18的突变会引起ragged(Ra) 缺陷（Pennisi D et al,2000 ；James et al，2003），杂合体几乎完全缺少胡须和被毛，突变小鼠毛被中zigazg毛的比例减少，另外还观察到毛干中的黑色素着色减少。因此SOX18对于次级毛囊大小和比例有重要的作用。是否在绒山羊次级毛囊的密度和大小也有关还有待于进一步研究。BMP-2和BMP-4被Noggin抑制活性的平衡

17、状态将刺激毛囊发育的开始。有意思的是选择性的永久缺失Noggin将影响次级毛囊（代表了90%的小鼠毛囊）的诱导过程，而初级毛囊则出现凋亡（Tatiana et al，2002；Saitoh et al，1998）。BMP2和BMP4在出生2周羊羔中表达量上调分别为6倍和2倍。表明这一阶段仍然是毛囊大量发育的阶段，这与绒山羊次级毛囊在出生后仍然继续发育相一致。FK506结合蛋白也出现在小鼠的毛乳头细胞中（Sleeman et al，2000）。FK506结合蛋白家族的成员除了5上调外，其余的7、9、10、11均在在新生羔羊皮肤中下调。说明这个家族的成员7、9、10、11在毛囊发育早期发挥更为重要

18、的作用。上 调下 调S100钙结合蛋白A1Frizzled-2S100 钙结合蛋白A16TNF 诱导蛋白6S100 钙结合蛋白A4Frizzled相关蛋白2FGF-结合蛋白Follistatin Frizzled-8EGFRFollistatin-相似3Notch 1Integrin 5Integrin7integrinEIintegrin 4 同型3Integrin5Frizzled-10wingless-相关MMTV 整合位点6Frizzled 同源蛋白3TNF 受体21FGFR1 癌基因伴侣2TGF-3C10蛋白其他候选基因目前正在进行以下基因的克隆 BMP2 cDNA BMP4 cDN

19、A BMPR-B cDNA二、山羊FGF-5基因的克隆及敲除载体的构建 FGF-5敲除山羊 核移植体系 构建载体 序列克隆 FGF-5 29（一）绒山羊FGF-5部分序列的获得（二）敲除载体的构建及同源重组技术路线的设计（三）山羊核移植体系的优化（四）胚胎移植进展 22825 bp NW_001502127mRNA complement join ( 1.395, 22465.22825) CDS complement( 22465.22825 )（一）绒山羊FGF-5部分序列的获得1.序列分析 牛FGF-5基因1862(23)13875(26)1741(20)1862(23)1869(22)

20、4285(20)4340(25)13875(26)17933(25)17935(25)25747(27)9010(20)4273(20)4138(25)4005(22)扩增出约9kb的PCR的产物 2. Primer 设计Identity=97.9%Primer上游: 5-TCCCACGAAGCCAATATGTTAAGTA-3 25mer 4340-4364Primer下游: 5-CTGAAAACTCCTCGTATTCCTACAAT-3 26mer 13875-13900预计 PCR产物大小： 9483 kb预测 羊FGF-5基因组成为 Exons: 3 361 bp 104 bp 394 b

21、p Introns: 2 9483 bp 12486 bp3. PCR产物电泳结果M：1 kb ladderSample: PCR产物大小为9-10 kb，与预计大小基本一致M sample9kb片段用Sau3A酶切酶切产物PCR/ Sau3A克隆至 T-vector (pGEM-T easy promage pBS T-TianGen)快速鉴定重组克隆DNA4. 重组克隆的获得快速鉴定重组克隆5. 测序结果挑取15个克隆进行单向的测序序列在NCBI 用Blast 进行同源比对得出与牛FGF-5基因第一内含子同源性95%的序列比对证明获得了山羊FGF-5第一内含子的部分序列挑选其中不重叠的6个

22、克隆反向测序后经序列拼接后获得了4个质粒的完整序列质粒序列和牛FGF-5基因比较图Plasmid 21GATCCAGCCGGCTCTCGAAACAGCCCGGAGGGTTGGGTTGGAGGTGCGTCTGGGGGCCACGCACACACTTACCGGTCTCATGGGGATGGGGAATGGCGATTCCTGAGGTACAGGCTACTCCGAGGCTGGTGCAGACAGGCACCTTGTTTCCAGCTTGCCCTGGTCCCAAAGAGGAGCTCCAACCTGTGCCCGGAGCAAAACCAAAAATCTTTCTCCTTGTTTAGTTTCTGTTTACCTTCTGCTTCTGTT

23、TACCAGACTAGCATTTTTCACTGGGCAGCAAAGTGTACCCCTTTACCTGCCCATAACTGAACAGTTCTTCTAAAAATAACCAAATCTCACATACTCCCCTCTCACAACCGCTACCACAAATCTGAAATTGCTACATAATGTGTGTGCGTATATGTGTGTGTGTGTATCTGTATATGTCTCTTGTAGGTACGTACATATTTGCACATCATATACATATGGGATATATAGGTATATCAGACGGGAGACCAGACGTTCTCTCATTGGAAGAAGACAGTGATCTAGAAAACTGGACACGTTTCC

24、AGAGGGAGACGTGATGGACATTCGAATTATTAATTCCGGAGTTGGGTTTAGCAACGTTTAGTATCTTAAGACCATGACCAGACCTTGTGAGGGAGAGTGGCCGGCCTTTTGTCCCCAAGGACAATTAAAGGAAGGTTCTGTATTTTAGAGAAGCATTTAGAGGCAGTTCAGTTCGGTACAGGTGAAATTTTGTGGGTTTTTAATTAAGCCAAGTTTTAAAATTTCCTTCTTAGTTTAGCTCTCTTTCTTTCCCTCTTCGTTGTCTCCTCCTTCACTCTGAGTTTCCAAACCATCACTGCG

25、GTTCTGATTCTTCTCACTGTCTCTCCGAGGCAACAGAGGGGAAAGATGTGTGGGACTGGGGACATCTCTGCGGACGTTTTCCTCGGTAGGGCCAGATGGCTCTTCCAGCCGGGGCTGGTCCAACAGATAGACGCACAGCCCCAGCCTCAGGGACCCAGGGAGAACGGAAACGAGGCCAGGAGACAGCGCACAGTCATCCGGCCCGGAGTGTCAGCCTGGTGGTTCCCAGGTGTACTTAACTTTCTCTGCCTCAAGCCAATGACCCTACAGATTTCTTCTTAACCAAGCTCCAGAGGAGCG

26、GGGGCGCCACTGCGAGGCTGGCAGCTCCAACCCCCACGGGGGGGTTGGAGATGCGCACATCCGTGGGGTGGCCGGCTGGCAAGCTCTCCCTCGGGAGTTCAGGAGGCGGGAAGTGGGACGCGAGCGGGTCCACGCCTGCCCCTTGCCCCTGACTGCTCCTACCGCCTCTGCCTTCAGCTTGCTGTGCTGCCCGTGGTGAGGTGGCTTGGAGCACCGAACCCCAGAGAGGGCCTTCCGCGTCAGCCCGAGCGAATGCCAGGGCCTCCCACACGCTCTTCAGAGGGGACTGTTTTGTGTGTG

27、TGTGTGTGTGTTTTTAAGAATGTATGTATTTTTGACTGGGTCTTCCTTGCAGTGGCAGTCTTTCTGTACTTTCAGGAGCCCGGGCTACCCTTTCTTGTGGTGCATGGGCTTCTGATTGCAGCGGTTTCTCTTGTTGCAGAGTGCAGACTTCACTAGTCCCAGTGTGTGGGCGCGGTAGTTGAGGCACCGGGCTTAGTTGCTCAGGGGGATATGCAGTTTCCCTGGGACCAGGGATTGATC1689 bpPlasmid 22GATCTCTTAAGATACGCTGAGAGAACTTGGACCATGAGAACCA

28、TGGAGGATACATCAGTTTTACCTCATCATCTAATTTGACTGTCTGTGAGTTAGCAGTAATGGAAAACATACATTATTGTGACACAACTTGTTACTTCTGTAAAGAGTCAAAACTCTGCCATGAAACTGCATTCTAACAGGTTCTTCTAAACTCCATAATTTTCTGTAATGTTTGTCAGAAGAGAGAAATATATATGCATGTATGTTTCATGACTATCATTTGACATTAAAATTTTTGTGAACCCTGAATATTTTTTTGTTTTGTTATCAAAAGTACATTTCCCATAGATTTTGAAACATA

29、ATTTATTTAGTTAAGGTATACCCCTTAATGTAGTCTTAGCTTCTCATACAAGAGTTATCCCAAGTTTTAAAGACAAGAATCAAGCTCATTGCACATAGACTCTTATCATAAGGGAACGCTAAGGAAGGATGAAGATGGGCAAGACAAGATAGATGATAGAATTCCACTACTGAATAAAAACAAAACTTTCCTTTAATCTCTACATTTTCAAGTTTAGTTTCAATACAATGCTTCTGTTGGCCTATCTTGGGCCACTGAAGAAGAGGCAATCAAGTAACTGTCAGTTCAGGGAGCAAAAGC

30、TTAAGGCTATAGCTACACAAAGACTGACTGTTCACATAAAAATATGGAGATTACAGTCATGTATTTTGGCTAGCTTTTAAAAATCTGAATCTACTGTCAACCTTGATGTTAATGCAGAGTCAACCTTTATATAGCCCCCCGAAGCCCAAATAAACCAGAATCTATACGGAAAAACTCAGTGGCAAATTTGCTAACTTAATGAAGACTGCTAAACTCAGATTTCAAGACTCGGATTTCATAATGACTTGTCATATTTGTTGCTGTGTGAAGCCAAGTAGAGAAACATCAGTTTTAAATGAT

31、TAATCTTTGGGAGTTTTCAGATGGGCTGTTGAAATCTCCTGAATACATGGAATATTTGTGTATCTTATTCACAGATAAAACAGAAAAAAGGGAGACGTCTACATAACTGTATCAAACATCATTGATAAGAGTCTTATTGTATTAAAAATTCTAGAGGGGACTAAGTGAACAAATCTAGATAGAGATTTTCTTATGGGAATAAGTTTATTTTGTAATGAACACCTAATGCTTGTAAATGGGTTAAGCAGTGCGAGACTCTGAACCCCTGCATCCTTTAACCTAGATGTCAATCCCAGAATT

32、CCACCAAGAG1253 bpPlasmid 29GATCTCTTAAGATACGCTGAGAGAGCTTGGACCATGAGAACCATGGAGGATACATCAGTTTTACCTCATCATCTAATTTGACTGTCTGTGAGTTAGCAGTAATGGAAAACATACATTATTGTGACGCAACTTGTTACTTCTGTAAAGAGTCAAAACTCTGCCATGAAACTGCATTCTAACAGGTTCTTCTAAACTCCATAATTTTCTGTAATGTTTGTCAGAAGAGAGAAATATATATGCATGTATGTTTCATGACTATCATTTGACATTAAA

33、ATTTTTGTAAACCCTGAATATTTTTTTGTTTTGTTATCAAAAGTACATTTCCCATAGATTTTGAAACATAATTTATTTAGCTAAGGTATACCCCTTAATGTAGTCTTAGCTTCTCATACAAGAGTTATCCCAAGTTTTAAAGACAAGAATCAAGCTCATTGCACATAAACTCTTATCATAAGGGAACGCTAAGGAAGGATGAAGATGGGCAAGACAAGATAGATGATAGAATTCCACTACTGAATAAAAACAAAACTTTCCTTTAATCTCTACATTTCCAAGTTTAGTTTCAATACAATG

34、CTTCTGTTGGCTTATCTTGGGCCACTGAAGAAGAGGCAATCAAGTAACTGTCAGTTCAGGGAGCAAAAGCTTAAGGCTATAGCTACACAAAGACTGACTGTTCACATAAAAATATGGAGATTACAGTCATGTATTTTGGCTAGCTTTTAAAAATCTGAATCTACTGTCAACCTTGATGTTAATGCAGAGTCAACCTTTATATAGCCCCCCGAAGCCCAAATAAACCAGAATCTATACGGAAAAACTCAAGTGGCAAATTTGCTAACTTAATGAAGACTGCTAAACTCAGATTTCAAGACT

35、CGGATTTCATAATGACTTGTCATATTTGTTGCTGTGTGAAGCCAAGTAGAGAAACATCAGTTTTAAATGATTAATCTTTGGGAGTTTCCAGATGGGCTGTTGAAATCTCCTGAATACATGGAATATTTGTGTATCTTATTCACAGATAAAACAGAAAAAAGGGAGACGTCTACATAACTGTATCAAACATCATTGATAAGAGTCTTATTGTATTAAAAATTCTAGAGGGGACTAAGTGAACAAATCTAGATAGAGATTTTCTTATGGGAATAAGTTTATTTTGTAATGAACACCTAATGC

36、TTGTAAATGGGTTAAGCAGTGCGAGACTCTGAACCCCTGCATCCTTTAACCTAGATGTCAATCCCAGAATCCCACCAAGAGAGAATAATTCCTTCAGTTTAACACTGCTTTTTACTTTTGATC1296 bpPlasmid 34GATCACATTATGCAACGTTTAAGTGCTCTATAAAGATACTCATAAATGTGTTTTAGGTATTTTATACATGTGTATCCACAATACACTGCTTCTTGTATATTGAATAATTTTATATGTACTTCAAATACTGCAGGAGGAGATTATTATGTTAAGAAAATCT

37、GGTGAACTTCCCTATTCAACAGAGTCCTATTGAAATATTCTAACCAGAATGTATGCTTAAAATACTACAGATTGAAATATTGATATTTTTTTCGTTTTCCCTTCCACTCCCACTTGCTTCCTTCCTTTCTTCCAGGGCAGGTCCCTTTATAGCTTTAATAAATAATATTATTTTATCTTTTTTTTTTTTGCAATTTGATGTAGGCAGTTAACAAAATGCCCCAGGCTTTTCTCTTGTTCATTTACCATTACATATGATTTTATGGTAAACAGGCAGGAATTCCAATTATATACAGACTAT

38、GAGTTTCAGCTTCTTAAAAATACTCTATGAACTGTGGTGTGCAACTCTTTTGACCCAGTGGATGTGAACTTTCAAATTACTATAGCAGACAGAGGGACATAGACTTGGTAATTCTCACTATGAAATACCAAATATAAATGATAACATAATAAAATACCTCATGAAATTTTTTCCAGGAGAGTCATTCAAAACGCAAGATGTCTCAAACCATAATCCATCAAACACTTCATTGAGCTAACAACCCCAAATTATCTATGGTGCTTTCAGTGTCTTGTTATGTGTAATCTTGAAATAAGCAAC

39、CACTAAATGATAGGGTATGATATATATTGATTTGTACTTTTATAATTATGGTCATTTGAGAAGAGGGATTTTTTTATTTAATTGAATATTATTTTCAAAGCTTCCAATGATGTATATTAATCTTGAGTGCAGTTGTATGTGCTTTAATATTCAATGTACTGTGTTATCTTTGACAGAGCAACAATGCATGAGAATTATTTTGTAAAACATTTTTAAAAGTCTTTTCCATTTCCTTAGAATTTGAAAAGATTCTTCTGCCAAACACTGATTACTAACAGTGACATCATTTTCAGGAAAAAA

40、TGAATACTAATGAAGCACAACTAAATTTTAAACCTTGAAATTTATCTTTTTAAATGAATACTTGAGCCCCAAACCTTTTTTTCCCTTTTACATAATAAATGTCACAATAAACAAGGATGTCAAATACTTAAAAAAAAAATCACTGTAATAAAGAATGGAAAGAGTCTCTGTAGAAATTTAAATCTTCACAATGATATATAGAGGAGTCTGTGTTTTATTTTGGGATTTCTGTCATCCTAGGTATTTTGGAAATATTTGCAGTGTCTCAGGGGATTGTAGGAATACGAGGAGTTTTCAG13

41、58 bp（二）敲除载体的构建及同源重组技术路线的设计由中国农大，李宁教授馈赠Homologous recombinationLeft arm：2-3 kb PCR testingright arm：4-6 kbLeft arm：2-3 kbRight arm：4-6 kb（三）山羊核移植体系的优化目标：内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞的分离和培养：建立内蒙古白绒山羊成年期和胎儿期成纤维细胞系。山羊卵母细胞体外成熟，孤雌激活，体外受精及克隆胚胎体外发育体系摸索山羊克隆胚的构建及体外培养克隆胚的移植及克隆羊的鉴定1 内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞的分离和培养A:内蒙古白绒山羊成纤维细胞组织块贴壁法游离

42、出的原代细胞B:F5代成纤维细胞C:F10代成纤维细胞D:F10代细胞染色体分析2 山羊核移植体系条件优化三种不同成熟液对山羊卵巢的成熟效果组别重复数成熟卵数（个）排极体率（%）1332665.95a2333749.2b3332076.47c组别1添加15%优质胎牛血清的成熟液，组别2添加15%自然发情山羊血清，组别3添加15%PG处理后发情的山羊血清进行山羊卵母细胞的体外成熟，结果发现PG处理后发情的山羊血清成熟率(76.47%)高于优质胎牛血清(65.95%)，差异极显著，自然发情山羊血清成熟率最低为 49.2%差异极显著。 E 成熟前山羊卵母细胞,F 成熟后山羊卵母细胞, G排出极体的卵细胞 ,H H3342染色后显示极体位于核附近孤雌激活摸索发育体系激活方法激活卵数卵裂率（%）电激活+6-DMAP81955.3a(453/819)Inomycin+6-DMAP74278.1b(579/742)发育液为sofaa组别培养液重复数囊胚数