基因工程复习重点(上师大)

1、节概述一.基因工程概念及特点1.概念2.显著特点3.基因工程在生物学研究领域中的地位二.基因工程的诞生及其发展史1.基因工程产生的基础 （1）理论上的三大发现 发现DNA是生物体的遗传物质 明确DNA双螺旋结构模型和半保留复制机制 遗传密码成功破译、“操纵子学说”的提出（2）技术上的三大发明建立DNA体外切割技术与连接技术载体的使用和大肠杆菌转化体系的建立逆转录技术、DNA序列分析、琼脂糖电泳等技术的建立2.基因工程的诞生Berg等人：SV40的DNA与DNA组合Cohen等人： TR 质粒与KR质粒重组转化无抗性大肠杆菌筛选双抗性菌落(TRKR)3.基因工程的快速发展（1）利用原核生物成功表

2、达真核生物基因非洲爪蟾rDNA导入大肠杆菌表达利用原核细胞产生人生长激素释放抑制因子（2）重要生物基因组研究（3）生物技术其他领域的发展生物技术主要研究领域基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程（4）分子生物学实验技术的发展第二节 基因工程的研究内容及其应用一.基因工程基本技术路线及主要研究内容1.制备目的基因2.制备载体3.DNA体外重组4.重组DNA导入受体细胞及扩增5.筛选转基因细胞6.鉴定转基因细胞中的目的基因7.实现目的基因的功能表达二.基因工程的应用1.基因工程在生物学研究领域得到广泛应用利用“反向生物学”方法研究基因功能基因之间相互作用及相互调控的研究2.基因工程在医药领域中的

3、应用（1）基因诊断（2）基因治疗（P7）（3）基因制药第一个被成功制备的基因工程药物-人生长激素释放抑制因子第一个被批准生产和使用的基因工程药物-人胰岛素利用基因工程生产的药物种类(主要为蛋白质药物)基因工程药物生产的四个不同阶段基因工程药物生产的主要优点产量高安全性好药用功能强制造新型药物3.基因工程在国民经济发展中的作用（1）提高粮食作物的产量和品质提高作物光合作用效率 创造新的固氮作物提高作物抗逆性获得营养品质和食用品质优良的农作物（2）转基因技术在畜、牧、渔业中的应用（3）基因工程与工业酿酒工业食品工业医药工业（4）基因工程与环境保护环境检测环境污染净化第三节 基因工程的安全性一.基因

4、工程早期的安全性争论1972-1973年研究初期1975年，16国会议1977年后研究成果陆续诞生第三节 基因工程的安全性二.基因工程的安全性问题对人体的安全性对环境的安全性三.基因工程技术应用的安全管理例:转基因水稻安全评价之一-中间试验第二章 基因工程的基础知识与基本技术第一节 基因工程的基础知识一.基因的结构特点1.基因基本结构启动子（P17）转录区终止子启动子 转录区 终止子基因2.原核生物基因的结构特点（1）操纵子结构原核生物启动子结构-35区和-10区的作用：Pribnow盒（-10区） -打开双螺旋，形成开放型启动子复合物 -RNA聚合酶定向作用，控制RNA53方向合成-35序列

5、 -RNA聚合酶因子结合位点转录区起点（+1）5TTGACANNNNNNNNNNNNNNNNNTATAANNNNNN（A/G）NNNNN 33AACTGTNNNNNNNNNNNNNNNNNATATTANNNNN（T/C）NNNNN 5 DNA-35-10区+1TTGACATATAAA/G（2）原核生物mRNA的特征半衰期短多顺反子存在SD序列SD序列的作用：P19启动子 转录区 终止子转录转录区OH-AUUCCUCCACUAG-316SrRNA-AGGAGGU-AUGCGAGCUUUUAGU-mRNA5-10-20-30起点+1AUGmRNA53（3）原核生物基因的终止子特点UUUUGGAGC

6、CUUU高G+CUUUUUAUU3末端mRNA末端CCUCGGAAA转录终止序列的一般特征反向重复ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA3553高G+C高A+T反向重复本征终止子 2.真核生物基因的结构特征（1）启动子特点-25 -30：TATA序列-70 -80：CAAT序列-80 -100：GC序列（2）基因不连续性（3）内含子（4）外显子（P20）（5）连接区(5GT-AG3法则)基因启动子 转录区 终止子AUGUAA5UTR3UTR转录二.从DNA到蛋白质1.基因表达概念(P22)2.基因表达过程及调控以

7、反义链为模板转录合成的RNA链按5 3方向生长（1）原核生物的基因表达RNA聚合酶组成：2（全酶）、2（核心酶）转录与翻译偶联（2）真核生物的基因表达由三种RNA聚合酶控制不同RNA转录信号传导基因顺式作用元件DNA结合蛋白质（转录因子，反式作用因子）三.基因研究进展1. 遗传密码与信息流2. 结构基因和调节基因（P27）3. 管家基因和奢侈基因（P27）4.移动基因5. 重叠基因6.假基因7.串联基因簇8. 基因组（1）原核生物基因组的特点P29（2）真核生物基因组的特点P29第二节 基因工程的基本技术一.核酸凝胶电泳1.基本原理 DNA等电点偏酸，当处于电泳条件（PH=8）时，DNA链上带

8、有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动。在电泳中，长度及构型不同的DNA片段将被分离。 2.凝胶类型3.凝胶分辨力同凝胶类型及浓度的关系4.溴化乙锭的作用溴酚蓝的作用上样缓冲液的重要成分及作用二.PCR技术 1.一般程序（高温变性、低温退火、适温延伸）2.反应体系（1）引物（2）TaqDNA聚合酶在栖热水生菌中分离获得以单链DNA为模板，以引物为起点，按53方向合成新生互补链无35外切酶活性最适合成DNA温度为72 C（3）反应缓冲液（4）模板（5）dNTP3.PCR的相关技术与应用前景（1）全基因克隆及检测（2）逆转录PCR（RT-PCR）获得目的基因cDNA序列以mRNA反转录获得的cDN

9、A为模板进行PCR（3）锚定PCR技术获得目的基因cDNA序列用于在体外扩增未知DNA序列的方法（4）基因的体外诱变与突变的检测（5）基因组比较研究随机扩增多态性DNA技术（RAPD） 用于研究不同生物的亲源关系PCR法引入酶切位点引物设计:53355-GGGAATTC 引物1CTTAAGGG-5引物253355333 5-GGGAATTCCTTAAGGG-553CTTAAGGG-5引物2 5-GGGAATTC 引物13 5-GGGAATTCCTTAAGGG-53CTTAAGGG-53 3-CCCTTAAG 5-GGGAATTC CTTAAGGG-5GAATTCCC-33 5-GGGAATTC

10、 引入EcoR位点5-GGGAATTCCTTAAGGG-5CTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCCC-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCGG-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-5 3-CCCTTAAGGAATTCGG-3 5-GGGAATTCCTTAAGGG-53 3-CCCTTAAG 5-GGGAATTC CTTAAGGG-5GAATTCCC-33 5-GGGAATTC三.分子杂交1.核酸杂交基本理论DNA变性DNA复性不同核酸分子杂交（DNA-DNA，DNA-RNA）2.印迹3.核酸探针及标记（1）核酸探针概念(P34)（

11、2）探针标记物（放射性同位素、非放射性标记物）（3）体外标记化学标记法或酶促法4.常用分子杂交类型（1） Southern印迹杂交（Southern blotting）概念（P35）应用主要操作步骤（2）Northern 印迹杂交（Northern blotting）概念应用（3）菌落原位杂交（4）组织原位杂交（5）斑点杂交（6）蛋白质印迹技术（Western blotting）概念应用第三章 基因操作的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶一.寄主控制的限制与修饰作用1.寄主限制与修饰现象的解释限制性核酸内切酶DNA甲基化酶 2.寄主限制与修饰的生物学作用(P43)3.寄主限制与修饰现象发现意义由

12、此发现了限制性核酸内切酶二.限制性核酸内切酶的分类与命名1.分类(型、型、型)2.命名属名+种名+菌株（或型）+ 修饰体系类型三.型限制酶的特性与DNA切割1.识别序列的主要特点长度为4-8个核苷酸在DNA连上呈连续分布，或间断分布DNA序列呈回文结构2.切割方式（1）平切（2）错切3.同裂酶与同尾酶（1）同裂酶概念 P46完全同裂酶不完全同裂酶（2）同尾酶概念 P46四.影响限制酶活性因素1.DNA纯度（1）杂质影响（2）弥补的办法增加酶用量扩大反应体系延长反应时间2.DNA甲基化程度3.温度4.DNA分子结构5.缓冲体系第二节 DNA连接酶类一.两种DNA连接酶1.大肠杆菌DNA连接酶只连

13、接粘性末端2.T4 DNA连接酶粘性末端和平末端都能连接二.DNA连接酶的连接作用及特点连接3,5磷酸二酯键5- POH-3连接酶5- POH-35- POH-3无活性连接酶5- POH-35- POH-3三.连接效率的判断1.凝胶电泳2.遗传转化四.影响连接反应的因素1.温度2.连接酶的用量3.连接时间4.插入片段大小5.插入片段与载体分子之比第三节 DNA聚合酶一.DNA聚合酶种类及主要特性1.大肠杆菌DNA聚合酶2. Klenow聚合酶3.T4DNA聚合酶4.T7DNA聚合酶5.TaqDNA聚合酶6.逆转录酶二.三类DNA聚合酶在基因操作中的重要应用1.一般DNA聚合酶：补平DNA、制备

14、DNA探针2. TaqDNA聚合酶：体外合成DNA3.逆转录酶：合成cDNA 第四节 修饰酶类一.S1核酸酶功能及应用催化单链RNA和单链DNA分子降解2.降解双链核酸分子内的单链区二.碱性磷酸酶主要功能及应用异源DNA连接前，除去5磷酸，阻止自身环化三.T4多核苷酸激酶功能及应用添加5缺失的磷酸基团四.末端脱氧核苷酸转移酶功能及应用在DNA链末端增加同源互补物第四章 基因克隆的载体基因克隆载体概念：P59基因克隆载体应具备的条件：P59第一节 质粒载体一.质粒的生物学特征1.质粒DNA多为环状双链多具有抗性基因有不同构型超螺旋（SC型）、开环双螺旋（0C型）、线状双螺旋（L型）SC0CL2.

15、质粒的分类（1）依据质粒自身传递性质分类接合型非接合型（2）依据是否引起宿主细胞新性状分类显性质粒隐性质粒（3）依据质粒的复制特性分类严紧型质粒：低拷贝数松弛型质粒：高拷贝数3.质粒的不亲和性亲和性非亲和性二.重要大肠杆菌质粒载体举例1.pSC101质粒载体 在基因工程研究历史上的重要性2.ColE1质粒载体含有松弛型复制子 3.pBR322及其衍生的质粒载体（1）pBR322质粒载体的人工构建（2）pBR322质粒优点分子量小具有较高拷贝数含有两种抗生素抗性标记基因 插入失活效应（3）pBR322质粒载体的改良pAT153质粒pBR325oriTetRAmpRpBR3224.pUC质粒载体（

16、1）四个组成部分pBR322的复制起始点氨卞青霉素抗性基因-半乳糖苷酶多肽基因片段（LacZ）多克隆位点（MCS)IPTG 诱导-半乳糖苷酶表达X-gal-半乳糖苷酶半乳糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 多克隆位点AmpRoriLacZ蓝色化合物 -半乳糖苷酶显色反应原理：（2）pUC质粒载体互补检测（3）优点分子量小及拷贝数高适于用组织化学方法检测重组体含多克隆位点5.TA克隆载体可与PCR产物连接，扩增外源DNA的载体。三.理想质粒载体构建的基本方案1.减少体积2.减少酶切位点3.便于检测4.根据要求改造复制特性5.质粒安全性改造第二节 噬菌体载体一.噬菌体的一般生物学特征二.噬菌体载体的构建1

17、.噬菌体特性（1）DNA分子(cos位点)（2）DNA基因图（p79）必需基因区非必需基因区（3）DNA复制方式早期复制：型双向复制晚期复制：滚环复制 2.构建噬菌体载体的原则（1）切去部分非必需区（2）在非必需区制造限制酶切口（3）改变噬菌斑表型特征（4）建立DNA分子体外包装系统DNA体内包装过程 实现DNA体外包装的关键 同时获得合成两种不同外壳蛋白的缺失型噬菌体噬菌体DNA包装限制 控制在野生型DNA长度的75%-105%三.噬菌体载体类型1.插入型载体2.替换型载体第三节 柯斯质粒载体一.组成pBR322质粒噬菌体cos位点二.特性1.具有质粒特性高拷贝能力具有抗生素抗性基因产生菌落

18、2.具有噬菌体载体部分特性体外包装高效转导3.具有高容量的克隆能力三.柯斯载体克隆外源DNA一般操作程序cosAmpR限制酶位点真核生物DNA限制酶消化连接包装入噬菌体感染选择转化子第四节 单链DNA噬菌体克隆载体一.M13噬菌体的生物学特性二.构建M13克隆载体的策略和途径三.M13克隆载体特点及应用第五节 噬菌粒载体一.噬菌粒载体概念(P90)二.pUC118和pUC119噬菌粒载体第六节 人工染色体克隆载体一.人工染色体克隆载体的含义和特点1.含义2.主要特点能够克隆外源大片段DNA穿梭载体（P94）二.人工染色体克隆载体类型三.人工染色体克隆载体应用1.构建基因组文库2.基因治疗3.功

19、能基因鉴定第五章 DNA分子克隆第一节 重组体的构建一.粘末端连接二.平末端直接连接三.平末端修饰后连接1.同聚物加尾法2.加衔接物或接头连接法3.PCR法引入酶切位点的连接一.重组DNA分子的转化或转染第二节 重组体导入宿主细胞1.概念（P109）2.转化与转染的主要区别3.重组DNA分子导入大肠杆菌细胞的关键 成功制备大肠杆菌感受态细胞4.转化和转染频率的确定 P110二.重组体分子的转导三.直接转化技术1.电激法2.显微注射法3.基因枪法第三节 重组体克隆的筛选与鉴定转化子（P112）重组子（P112）期望重组子（P112）第三节 重组体克隆的筛选与鉴定一.表型特征筛选（遗传检测法）1.

20、利用载体提供的表型特征选择2.利用插入序列提供的表型特征筛选二.菌落（噬菌斑）原位杂交筛选1.原理2.菌落（噬菌斑）原位杂交筛选操作三.免疫学方法筛选1.利用免疫学方法筛选必备条件克隆基因表达蛋白产物具备特异抗体2.标记抗体检测法3.免疫沉淀检测法1.凝胶电泳检测筛选2.限制酶谱分析筛选3.PCR法4.DNA测序法四.结构分析筛选五.转译筛选法1.主要特点（1）能确定克隆DNA与其编码蛋白质之间的对应关系（2）采用无细胞系体外翻译系统2.两种筛选策略及应用（1）杂交阻断转译法（2）杂交释放转译法第六章 目的基因的获得第一节 化学合成法获得目的基因一.亚磷酸三脂法H3保护基团G5保护基团 T 5

21、A保护基团G保护基团保护基团OH 去5保护基团OHH5CH25CH20G3214OPOOO03214OPOOOOH保护基团保护基团1.原理二.基因的组装 三.化学合成寡核苷酸的应用1.合成基因元件2.PCR引物3.核酸分子杂交的探针第二节 PCR技术获得目的基因一.PCR技术获得目的基因全长序列二.反转录PCR获得目的基因cDNA1.已知目的基因序列的RT-PCR两对可用的引物反义引物（逆转录引物:RT-GSP）与正义引物（GSP） Oligo（dT）12-18与正义引物（GSP）2.从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCRVal Phe Asn Ala Trp Lys Asp His可能的

22、DNA顺序：GTN TTT/C AAT/C GCN TGG AAA/G GAT/C CAT/C 设计兼并引物已知N端部分氨基酸顺序：（1）从氨基酸顺序设计核酸引物（2）利用兼并引物RT-PCR操作获得特异材料TTTTTAAAAA5353AAAAA53反转录33AAAAA5TTTTT5TTTTT335TTTTTAAAAA5Oligo（dT）兼并引物三.依据基因部分序列信息获得基因全长序列1.反向PCR分析某个已知区段两端的未知序列巢式PCR嵌套引物2.盒式PCR（1）盒式PCR概念P136 （2）cassette概念P1363.RACE技术（1）概念P137（2）RACE种类 3RACE 5RA

23、CE四.锚定PCR技术获得目的基因cDNA序列用于在体外扩增未知DNA序列的方法获得特异材料锚定引物AAAAA53mRNA反转录53AAAAATTTTT53sscDNAGGGAATTC CCCC5GGGAATTC CCCC5 dscDNAGGGGPCR53TTTTT5GGGAATTC CCCC5GGGG35GGGAATTC CCCC53 CCCTTAAGGGGG355GGGGDNA末端转移酶去mRNA5TTTTT3第三节 筛选基因文库获取目的基因一.基因文库概念及种类1.概念P1392.种类基因组文库cDNA文库二.基因文库的构建1.基因组文库构建克隆数的确定两个重要参数:基因组大小克隆DNA片段的平均大小2.基因组文库构建基本操作生物基因组DNA提取和DNA片段化载体选择和制备DNA片段与载体连接重组载体导入微生物细胞初库的扩增保存终库三.cDNA文库的构建1.基本操作过程（1）总RNA提取（2）mRNA的分离纯化（3）cDNA的合成cDNA第一链合成双链cDNA合成自身引物合成法置换合成法引导合成法-5端不完整dscDNA-接近全长dscDNA-全长d