《食品生物化学》课件

1、第五章蛋白质化学蛋白质最早在1983年由伯齐利厄斯首先提出英文“Protein”这一术语，来自希腊文，它的意思是“最原初的”或“第一重要的”，中文译为“蛋白质”形容它像鸡蛋白那样的物质。有些学者曾根据Protein原义建议设新字“朊”表示，但因蛋白质一词沿用己久，“朊”字一直未被广泛使用。 生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。 恩格斯反杜林论1878第一节 蛋白质的概述一、蛋白质定义及生物学意义定义蛋白质是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键铆（蛋白质化学中专称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并且具有一定生物功能的生物大分子。5、参

2、与机体的防御： 如抗体或称免疫球蛋白6、接受传递信息： 如味觉蛋白、视觉蛋白7、调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达8、其它： 如鸡蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是营养和储存蛋白； 胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白； 甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能所以说 “ 没有蛋白质就没有生命 ”二、蛋白质的化学组成蛋白质是生命活动的物质基础。生物体内的蛋白质是除水以外，机体组织中最多的组分，占人体干重的45%，占细胞干重的5070% 。含氮量与蛋白质含量换算：N 是蛋白质中特征元素，且含量恒定，约为16% ，即16 克氮相当于100 克蛋白质，故可以用定氮法测定样品中蛋白质含量，通常采用微量凯

3、氏定氮法先测定样品含氮量，再按下式计算蛋白质含量：蛋白质含量（g）样品含氮量6.25（g）6.25即为 1/16%蛋白质的分子组成蛋白质可以被酸、碱和酶催化而完全水解，水解的最终物是氨基酸的混合物。而氨基酸是不能再水解的最小单位，因此，氨基酸是组成蛋白质的基本单位。在自然界，氨基酸多以结合形式存在于蛋白质中，以自由形式存在者很少。根据分子形状球状蛋白质（分子对称性佳，外形接近球状或椭球状，溶解度较好，能结晶，大多数蛋白质属于这一类 ）纤维状蛋白质（对称性差，分子类似细棒或纤维。又可分成可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质 ）根据组分简单蛋白质：完全由-氨基酸组成结合蛋白质除蛋白外还有非蛋白成

4、分（辅基）根据功能分活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白和受体蛋白）非活性蛋白（如硬蛋白、角蛋白）三、蛋白质的分类四、蛋白质的大小与相对分子质量蛋白质是由20种基本AA组成的多聚物，AA数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50个AA的低分子量的多聚物称为肽、寡肽或生物活性肽，有时也称多肽。多于50个AA的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。第三节 蛋白质的基本结构-氨基酸 蛋白质是一类含氮的生物大分子，相对分子质量大，结构复杂，但如用酸或蛋白酶处理使其彻底水解，最后可以得

5、到各种氨基酸。实验证明氨基酸是蛋白质的基本组成单位。氨基酸是指含有氨基的羧酸。自然界发现的氨基酸有200余种，但组成蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸也称为蛋白质氨基酸或称基本氨基酸。蛋白质和多肽的肽键可被催化水解酸/碱能将蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解得到各种AA的混合物得到多肽片段和AA的混合物氨基酸是蛋白质的基本结构单元 一、蛋白质的水解 蛋白质朊胨多肽二肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200-500 100 氨基酸的分类1、按氨基酸分子中羧基与氨基的数目分： 酸性氨基酸： 一氨基二羧基氨基酸 天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸： 二氨基一羧基氨基酸 赖氨酸、精氨

6、酸、组氨酸中性氨基酸： 一氨基一羧基氨基酸甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 甲硫氨酸 半胱氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 酪氨酸 脯氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺 丝氨酸 苏氨酸2、按侧基R基的结构特点分： 脂肪族氨基酸： 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、 天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸 杂环氨基酸： 脯氨酸、组氨酸 芳香族氨基酸： 苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸4、按氨基酸是否能在人体内合成分： 必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基酸， 必须从食物中摄取。有八种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。

7、（缬异苯蛋亮色苏赖） 非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十种： 甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 天冬酰氨、谷氨酰氨、脯氨酸、酪氨酸、胱氨酸 半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足 人体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸。有两种：组氨酸、精氨酸构成蛋白质的二十种氨基酸二十种氨基酸的名称和结构如图所示:吲哚基 含-氨基的氨基酸：赖氨酸 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 亚氨基酸：脯氨酸 含咪唑基的氨基酸：组氨酸 含胍基的氨基酸：精氨酸 含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基） 含羟基的氨基

8、酸：丝氨酸、苏氨酸 支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸二十种氨基酸的结构特点形态均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。有六角、四角 、菱状、柱状等。如： L-Glu（四角柱） D-Glu（菱状）溶解性一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮、乙醚 ，在稀酸和稀碱中溶解性好。胱氨酸、半胱氨酸不溶于水酪氨酸微溶于冷水而溶于热水脯氨酸极易溶于水熔点氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于 200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。味感氨基酸都有一定味感，主要表现酸、甜、苦、鲜四种味感。旋光性除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。有的有多个旋光异构体，如苏氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。从氨基酸的结构通式

9、可以看出：除 R 为H（甘氨酸）外， 所有-碳原子为不对称碳原子 。氨基酸均具有旋光性。左旋（-），右旋（+）每一种氨基酸都有D-型和L-型两种立体异构体。构成蛋白质的氨基酸均为 L-氨基酸。各种氨基酸的区别在于侧基 R 基上。注 ：脯氨酸（Pro）为亚氨基酸，不适用上面的结构通式。亚氨基+-氨基酸的构型构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外，含有的-碳原子为手性碳原子，在空间该原子上的原子或基团有两种排列方式，L-构型与D-构型（以甘油醛为参照物）：L-氨基酸与D-氨基酸的关系互为镜像关系，象左右手的关系，以丙氨酸为例，如右图 Ala光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸

10、收。 max ：Tyr：275 Phe: 258 Trp：279氨基酸的两性电离及等电点两性离解：从氨基酸的结构通式分析可以看出：氨基酸分子在溶液中其氨基-NH2和-COOH均可发生电离。使氨基酸分子-NH3+ 带正电，羧基-COO-带负电。两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子。这种特性叫两性离解。 氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。As an acid（proton donor）：As a base（proton acceptor）：不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存

11、在： 氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point），以pI表示。氨基酸的等电点实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。 当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。 pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。 由于静电作用，在等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。利用这一性质可以分离制备某些氨基酸。例：谷氨酸的生产，就是将微生物发酵液的pH值调节到3.22(谷氨酸的等电点)而使谷氨酸沉淀析出。利用各种氨基酸的等电点不同，可以通过电泳法、离子交换法等在实验室或工

12、业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。氨基酸的等电点可由其分子上解离基团的解离常数来确定。各种氨基酸的解离常数pK和等电点pI的近似值可参考下页图表或其它教材。20种氨基酸的 pK，及pI氨基酸等电点的计算：各种氨基酸的等电点，一般通过实验在一定的缓冲溶液中测定，也可以从氨基酸的PK值求得。 氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被碱滴定，因此具有两性电离的性质，现以甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点。 左图是甘氨酸的电离酸碱滴定曲线，从左向右是用NaOH滴定的曲线，溶液的pH由小到大逐渐升高；从右向左是用盐酸滴定的曲线，溶液的pH由大到小逐渐降低。曲线中从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50%的状

13、态，第二个拐点是氨基酸的等电点，第三个拐点是氨基酸氨基解离50%的状态。 氨基酸等电点的计算：中性氨基酸： pK1 为-羧基的解 离常数pK2 为-氨基的解 离常数pI=(pK1 + pK2)/2+H3N-CH2-COO H2N-CH2-COO + H+ K2Gly +GlyK1=GlyH+Gly+ +H3N-CH2-COOH +H3N-CH2-COO + H+K1K2=Gly GlyGlyH+Gly 得：K1K2GlyH+2Gly+氨基酸等电点的计算公式推导：以甘氨酸为例：式 两边取负对数，得：pK1+ pK2 2pH+ lgGly+Gly 当 Gly+ Gly 时，甘氨酸所带正、负电荷相等

14、，即处于兼性离子状态，溶液的pH即为等电点pI： 即氨基酸的等电点与离子浓度无关，只取决于两性离子两侧可解离基团的pK值。甘氨酸的等电点为： pK1为-羧基的解离常数pK2为-氨基解离常数pI = ( pK1 + pK2 ) / 2氨基酸在等电点处溶解度最小，可沉淀析出。中性氨基酸：以Gly为例 K1=Gly H+Gly+K2=Gly- H+GlypI时，Gly+ = Gly- Gly H+K1=Gly K2H+H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97Gly等电点的计算酸性氨基酸以Asp为例：以Lys为例：碱性氨基酸通

15、过上述实例可知，由于羧基解离度大于氨基的解离度，所以含有一个氨基和一个羧基的中性氨基酸的等电点都在pH 6.0左右，如甘氨酸为5.97、丝氨酸为5.68、缬氨酸为5.96、异亮氨酸为6.02。至于碱性氨基酸（二氨基一羧基）的等电点值就较大，而酸性氨基酸(一氨基二羧基)的等电点值就较小。氨基酸的化学性质-氨基酸分子中有许多功能基团，-氨基，-酸基，侧链R基，按其化学反应分四个方面：-氨基参加的反应：与甲醛反应，与HNO2 反应- 具一级胱的性质；-羧基参加的反应：成盐、成酯、成酰胺、胱酸、酰氯化等-具羧酸的性质；-氨基，-羧基共同参加的反应：成肽、茚三酮反应；侧链R参加的反应：米伦反应、黄色反应

16、、分试剂反应、硫酸铅反应、坂口反应。由-氨基参与的反应： 与 HNO2 反应：放出 N2 ，N2 中的一原子 N 来自于 -NH2 ,另一原子 N 来自于 HNO2 用途：通过测定生成的氮气的体积量可计算氨基氮的量，此反应也可用于测定蛋白质的水解程度。特殊： Pro、Hpr 不与 HNO2 放氮 Trp、Arg、His 的侧链不与 HNO2 放氮 Lys 的侧链与 HNO2 反应慢RCHCOOH + HNO2 NH2RCHCOOH + N2 + H2OOH与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用 NaOH 滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。

17、 用途：此法用于快速测定氨基酸的含量，也常用于蛋白质水解程度的测定。CH2COONH3+H+ +CH2COONH2CH2COONHCH2OHCH2COON(CH2OH)2pK2HCHOHCHO与2,4-二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反应（Sanger反应）： 生成黄色的二硝基苯-氨基酸衍生物与苯异硫氰酸酯（PITC）反应（Edman反应）： 生成苯乙内酰硫脲-氨基酸与丹磺酰氯（DNSCl）的反应： 生成荧光物质 DNS氨基酸、反应用于多肽的N-末端的测定-羧基参与的反应：与碱反应成盐 与醇反应成酯 与酰化试剂反应成酰氯R1CHCOO + R2OHNH3+R1CHCOOR2 + H2ONH3成

18、酯反应： （是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体）RCHCOONHPGRCHCOClNHPGPCl3，PCl5 or SOCl2成酰氯反应： （是使氨基酸羧基活化的一个重要反应）-氨基与-羧基共同参与的反应 与茚三酮的反应： 氨基酸与水合茚三酮生成蓝紫色化合物（max570nm）用途：用于氨基酸的定性定量分析 灵敏度极高，微克数量级就可观察到颜色 纸电泳、层析等分离氨基酸的显色剂，也是定量氨基酸的依据 多肽、蛋白质均有此反应，肽键越长，灵敏度越差注：氨基酸与茚三酮的反应： 氨基酸与水合茚三酮反应的蓝紫色化合物其max=570nm， 该反应受到氨化合物干扰。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应 不释放 N

19、H3 而直接生成黄色化合物 (max440nm )。离子交换反应树脂SO3- H（Na） + NH3+-CH-COOHR树脂SO3- NH3+-CH-COOH + H+(Na)R阳离子交换反应离子交换剂： 支持物 功能基 反离子COOSO3PO3NH3+NR2H+H+ ( Na )OH(Cl)阳离子交换剂：阴离子交换剂： 上样：条件 pH 中性氨基酸(Aa+) 酸性氨基酸(Aa)溶液的离子强度: 越大 , 氨基酸结合越不牢固用阳离子交换树脂分离混合氨基酸的步骤：Millon反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应 Millon试剂：汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液 产物：红色的化合物侧链反应（

20、颜色反应）坂口反应：检测 Arg 或含 Arg 的蛋白质的反应 坂口试剂：-萘酚的碱性次溴酸钠溶液 产物：砖红色的沉淀Folin反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应 Folin试剂：磷钼酸、磷钨酸混合溶液 产物：蓝色的钼蓝、钨蓝Pauly反应：检测His、Tyr及含His、Tyr蛋白质的反应 试剂：对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液 产物：橘红色的化合物Cys的反应：Cys或含Cys蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨 的溶液中，产生一种红色的化合物。乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。 当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层 现象，界面出现紫色环。四、

21、氨基酸的分离与分析为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进行分析和分离工作。其方法较多，而目前使用较多的是层析法。分配层析的一般原理所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相（stationary phase），一个为流动相或动相（mobile phase）。混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（ partition or distribution coefficient）来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）。用下式

22、表示： CA 表示某一物质在动相中的浓度 Kd= CB 表示某一物质在静相中的浓度 物质分配不仅可以在互不相溶的两种溶剂即液相-液相系统中进行，也可以在固相-液相或气相-液相间发生。其系统中的静相可以是固相、液相或固-液混合相（半液体相）；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。在实际层析时，层析行为一般并不直接决定于它的分配系数，而是取决于有效分配系数Keffo： 某一物质在A相中的总量 Keffo= 某一物质在B相中的总量(2)分配柱层析层析柱中的填充剂或支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相，沿固定相流过

23、的与它互不相溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充剂构成的柱床可以设想为由无数的连续的板层组成，每一板层起着微观的“分溶管”作用。当用洗脱剂洗脱时，在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系数进行连续不断的进行分配移动。分部收集层析柱下端的洗脱液，然后分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。加洗脱剂氨基酸样品支持剂层析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）（3）滤纸层析滤纸层析也是分配层析的一种。这里的滤纸纤维素吸附水作为固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相

24、中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种溶剂系统进行第二相展层。由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具有不同的迁移率（ Rf ），因此它们就会彼此分开，当用茚三酮显色时，就会在滤纸上面出现各种氨基酸的斑点。当然，若氨基酸种类较少或一相就能分开，进行一相层析即可。 溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点XY滤纸层析中的Rf值，Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的双向滤纸层析图谱（4）薄层层析（thin-layer chromatography)：该层析分辨率

25、高，需量极少，层析速度快，可使用的支持剂种类多，如纤维素粉、硅胶、氧化铝等。其步骤大体如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成为一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分开，最后进行鉴定和定量分析。盖子层析缸溶剂薄层板（侧面）薄层层析装置（5）离子交换层析（ion-exchange column chromatography) 这是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网

26、状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯环SO3有氢型和钠型H+或Na+H+或Na+树脂分阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂含有的酸性基团如SO3H（强酸型）或COOH（弱酸型）可解离出H+离子，当溶液中含有其它阳离子时，例如酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而结合在树脂上。同样地阴离子交换树脂含有的碱性基团如N（CH3）3OH（强碱型）或NH3OH（弱碱型）可解离出OH-，它能和溶液中的阴离子如碱型环境中的氨基酸阴离子发生交换而结合在树脂上。

27、氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂的亲和力，主要决定于：它们之间的静电引力；氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。在PH为3左右的氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电引力的大小次序是碱性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脱顺序大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸。但有时并不是这样，这是因为某些氨基酸和树脂之间还存在着疏水作用。为了使氨基酸从树脂上洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的PH和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。（6）气相色谱 当层析系统的流动相为气体，固定相为

28、涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析技术称为气-液色谱（gas-liquid chromatography）或简称为气相色谱。它是利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同而达到分离组分的目的。 气相色谱需要气相色谱仪进行。 气相色谱具有微量快速的优点。（7）高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）：这是近十几年来发展起来的一种快速、灵敏、高效的分离技术。 HPLC的特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。因此多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离

29、子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。第三节 肽（Peptide）由两个或两个以上的氨基酸，由一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成新键-C-N-即酰胺键也叫肽键，所形成的这个化合物叫肽。一、肽和肽键由两个AA组成的肽称为二肽。由多个AA组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离-氨基的一端：氨基端或N-端含游离-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二、肽的理化性质1、两性解离与等电点肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末

30、端氨基、末端羧基和侧链R基。由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1。N端-NH3+的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2。R基的pK变化不大。肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。 例：已知末端-COOH，pK3.6，末端-NH3+pK8.0 -NH+3pK10.6。 计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。 pI=(8.010.6) /2 =9.32、肽的化学性质 双缩脲反应 肽键的紫外吸收210230nm 双缩脲 碱性CuSO4溶液 紫色三、天然存在的某些活性肽 肌肽和鹅肌

31、肽 肌肽（carnosine）:-Ala-His 鹅肌肽（anserine）：-Ala-1-Me-His 2、谷胱甘肽(glutathione,GSH) 3、多肽抗菌素 4、多肽激素 5、神经肽甲硫氨酸脑啡肽TyrGlyGlyphe- Met 亮氨酸脑啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：镇痛 如脑啡肽 (enkephalin) 第四节 蛋白质的分子结构 实验已经证明蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，再内一条或一条以上的多肽链按各自特殊方式组合成具有完整生物活性的分子。随着肽链数目、氨基酿酸组成及其排列顺序的不同，就有不同的三度空间结构也就形成了不同的蛋白质。目前已经知

32、道的蛋白质种类有100亿之多，是因为蛋白质的氨基酸组成和排列顺序不同而引起。蛋白质结构很复杂，人们为了研究方便起见，把蛋白质的空间结构分为以下几个层次：一级结构：初级结构或化学结构二级结构三级结构四级结构超二级结构结构域蛋白质的结构空间结构一、蛋白质的一级结构（primary structure） 国际化学会规定1、概念指蛋白质分子中多肽链上氨基酸残基的排列顺序（序列）就是蛋白质的一级结构。一级结构是空间结构的基础。连接方式：主要是肽键，还有二硫键。排列顺序：指从N-末端开始，到C-末端结束，各氨基酸的排列次序。多肽链的数目,二硫键的数目位置氨基酸的组成氨基酸间的连接方式氨基酸的排列顺序一级结

33、构的实质 蛋白质的一级结构（Primary structure）又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。 2、肽键与肽链肽键：一个氨基酸的-COOH 和相邻的另一个氨基酸的-NH2 脱水形成共价键。如右图：肽链：氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有自由 -NH2和 -COOH，自由-NH2 端称为N-末端（氨基末端），自由 -COOH端称为C-末端（羧基末端）。构成肽链的氨基酸已残缺，称为氨基酸残基。肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2 端开始，由N指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。两个不同氨基酸组成的二肽有2种; 三

34、个不同氨基酸组成的三肽有6种；四个不同氨基酸组成的四肽有24种；n个不同的氨基酸组成的多肽有 n! 种多肽。该肽命名：从 N 端C 端依次读出各氨基酸残基为氨基酰丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）二硫键：肽链有的成环状，有的是由一条以上肽链组成。肽链中除肽键外还有二硫键，它是由肽链中相应部位上两个半胱氨酸残基脱氢连接而成的，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。二硫键在蛋白质分子中起着稳定肽链空间结构的作用，往往与生物活力有关。当二硫键破坏后，蛋白质或多肽的生物活力就消失，例如胰岛素分子中的二硫键受到破坏，活力就丧失，说明它们的生物活力与二硫键有关。一般二硫键数目愈多，蛋白质结构的稳定性就愈强。

35、生物体内起保护作用的皮、角、毛、发的蛋白质中二硫键最多。3、蛋白质一级结构确定蛋白质的一级结构是最基本的，它包含着决定蛋白质高级结构的因素。确定的要点测定蛋白质中氨基酸组成；蛋白质的N端和C端的测定；应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段；分离提纯所产生的肽，并测定出它们的序列；从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。（片段重叠法）确定的原则（片段重叠法）蛋白质一级结构测定的原则是将大化小，逐段分析、先后果用不同方法制成两套肽片段。并对照两套肽段，找出重叠片段，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。下面的数据是从一个

36、八肽降解和分析得到的，其组成是：Ala、Gly2、Lys、Met、Ser，Thr、Tyr。该八肽 用CNBr 处理，得到：Ala、Gly、Lys、Thr Gly、Met、Ser、Tyr ；用胰蛋白酶处理，得到：Ala、Gly； Gly、Lys、Met、Ser、Thr、Tyr ；用糜蛋白酶处理，得到：Gly、Tyr Ala、Gly、Lys、Met、Ser、Thr 。经分析，N-末端残基是：Gly ，C-末端残基是：Gly 。请确定该肽的氨基酸顺序。 GlyTyrSerMetThrLysAlaGly一级结构推测顺序举例：二、蛋白质的空间结构（Space Structure）蛋白质的多肽链在一级结构

37、的基础上，按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成的空间构象（又称高级结构）。其实质是多肽链在空间的排列方式的肽链的走向。蛋白质的二级结构Linus Pauling 和 Robert Corey 于 20 世纪 40 年代末至50 年代初，根据X-射线衍射法技术对-角蛋白等研究结果，提出了蛋白质分子构象的立体化学原则。 蛋白质分子构象的立体化学原则的要点肽链空间构象的基本结构单位为肽平面。所谓的肽平面是指肽链中从一个C原子到另一个C原子之间的结构，共包含 6 个原子（C、C、O、N、H、C），它们在空间共处于同一个平面。如下图所示：肽键上的原子呈反式构型。肽键 C-N键长为 0.132nm ，比一

38、般的 C-N单键 (0.147nm)短，比 C=N双键(0.128nm)要长，具有部分双键的性质(partial double-Bond character)，不能旋转。而 C-C、C-N为真正单键（pure single bond），可以旋转。相邻肽平面构成二面角。一个C原子相连的两个肽平面，由于 N-C 和 C-C(羧基碳)两个键为单键，肽平面可以分别围绕这两个键旋转，一个肽平面围绕 N-C(氮原子与-碳原子)旋转的角度，用表示。另 一个肽平面围绕 C-C(-碳原子与羧基碳)旋转的角度，用表示。这两个旋转角度叫二面角（dihedral angle)。二面角角：肽平面围绕 N-C 旋转的角度

39、角：肽平面围绕 C-C 旋转的角度二面角(,)确定后，一个多肽链的二级结构就确定了。规定0，当 CC 两侧的 N1C1 和 C-C2 呈 顺式排列时0，当 CC2 两侧的 CN1 和 C2N2 呈 顺式排列时: 0180 从 C 向 N1 看，顺时针旋转，为正，反时针旋转，为负；： 0180 从 C 向 C2 看，顺时针旋转，为正，反时针旋转，为负。蛋白质二级结构主要类型（1）-螺旋（2）-折叠（3）-转角（4）自由回转 -螺旋（-Helix）: 又称为 3.613 螺旋，= -57，= -47。结构要点：多肽链绕一条固定轴旋转形成右手螺旋。每 3.6 个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm

40、 ，相邻两个氨基酸残基间的距离为 0.15nm 。相邻两圈螺旋之间借肽键中 CO 和 N-H 形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的 NH 和前面相隔三个残基的 CO 之间形成氢键，这是稳定-螺旋的主要键。肽链中氨基酸侧链 R ，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响-螺旋的形成。-螺旋表示为：3.613-螺旋在许多蛋白中存在，如-角蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等，主要由-螺旋结构组成。螺旋的结构通常用“ ns ” 来表示，n 表示螺旋每旋转一圈所含的残基数，s 表示形成氢键的 C=O 与 H-N 原子之间在主链上包含的原子数。 螺旋的其他形式310螺旋和螺旋：不稳定的螺旋影响-螺旋稳定的因素：

41、 酸性或碱性氨基酸集中的区域，有相同电荷相斥作用，不利于-螺旋形成； 较大的 R （如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸）集中的区域，也妨碍-螺旋形成； 脯氨酸是-螺旋的最大破坏者，因其-碳原子位于 五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，遇 Pro，-螺旋中断； 甘氨酸的R 基为 H ，空间占位很小，也 会影响螺旋的稳定，也是-螺旋的破坏者。-折叠(-pleated sheets)又称-片层、-结构，结构要点：有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其= -119，= +113。反平行折叠其= -139，=+135。这种片层在丝心蛋白里大量存在。相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm或0

42、.325nm，侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连；多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；-折叠片层的两种形式： 1、平行式 2、反平行式反平行的-折叠片氢键2侧面观顶面观R-基团突出于片层两端多肽链几乎完全伸展-139 +135 平行的-折叠片氢键顶面观侧面观5蛋白质中平行与反平行的混合结构 几乎所有的-结构都倾向于右旋，因为单链总是趋向于向右扭转，与之对应的是链内氢键。-转角 : 又称-弯曲，-回折或发夹结构。指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现180的回折，回折处的结构就称为-转角。一般由四个连续的氨基酸组成，第一个氨基酸的羧基与第四个氨基酸的氨基形成

43、氢键。也有一些是由第一个氨基酸的羧基与第三个氨基酸的氨基形成氢键。 -转角180甘氨酸和脯氨酸最易引起180转角氨基酸2和3之肽键可自由的与水形成氢键自由回转(又称无规卷曲、自由绕曲)是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域里，所以受到人们的重视。小结：不同蛋白质的二级结构不同，有的相差很大，例如肌红蛋白分子中肽链中约有75是-螺旋结构。 -角蛋白几乎全是-螺旋结构，而蚕丝丝心蛋白却又几乎全是-折叠结构。超二级结构和结构域近年来在研究蛋白质构象、功能和进化中的变化时，常常引入超二级结构和结构域的结构层次，作为蛋白质二级结构至二级结构层次的一种过渡态构象层次。 超二级结构

44、（Super-secondary structure）超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中往往形成有规则的二级结构聚集体，在球蛋白中充当三级结构的构件。常见的有：、等。：由两股或三般右手-螺旋彼此缠绕而成左手超螺旋的构象。：由二段平行的-折叠和一段连接链组合在一起的超二级结构。：两段-折叠之间通过一段-螺旋片段连接组合在一起形成。-转角：若一条多肽链上连续而又相邻的3条反平行-折叠链由紧凑的-转角连接在一起可形成-转角。希腊式钥匙构象：在反平行-折叠片中还可出现希腊式钥匙花纹相似的回形拓扑结构。

45、超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具合功能的结构域。结构域（structural domain）结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状的结构。在空间上彼此分隔，各自具有部分生物功能的结构。对于较小的蛋白质分子或亚基，结构域和三级结构往往是一个意思，即这些蛋白质是单结构域的。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的结构域缔合而成三级结构。结构域通常含有100200个氨基酸残基，一般少则40个残基，多则40个以上。一条长的多肽链首先折叠成几个相对独立的结构域再缔合成三级结构。很多多结构域的酶分子，活性部位往往分布

46、在结构域之间的一段连接肽链上（该连接链通常称为“铰链区”)，有利于结构域发生相对运动，使活性部体利于结合底物和给予底物施加压力，也有利于别构酶充分发挥别构调节效应。结构域的结构层次介于超二级结构和三级结构之间。如图所示：蛋白质的三级结构三级结构的定义：多肽链中所有原子在二级结构、超二级结构，乃至结构域的基础上进一步沿多个方向卷曲、折叠形成的紧密的近似球状的结构称为蛋白质的三级结构。三级结构的特点大多数的亲水的R 侧基分布于球形结构的表面；疏水的R 侧基分布于球形结构的内部，形成疏水的核心；表面有一空穴（裂隙、凹槽、口袋），是蛋白质的活力部位，结合底物或配体。二级结构向三级结构转变的主要动力是疏

47、水相互作用。肌红蛋白（Mb）的三级结构：肽链的走向图哺乳动物肌肉中的储氧蛋白质含153Aa残基、Mw：17800、一个血红素辅基 八段螺旋： A1-16、B1-16、 C1-7、D1-7、 E1-20、F1-9、 G1-19、H1-14、远端His64（E7）近端His93（F8）肌红蛋白（Mb）的三级结构（原子填充图）一般来说，具有相似的一级结构通常具有相似的三维结构。但有时非常不同的一级结构（同源相似序列小于20）能形成非常相似的三维结构。血红蛋白亚基哺乳动物昆虫植物蛋白质的功能取决于它的三维结构，而三维结构是由其一级结构决定的。蛋白质的四级结构定义： 二个或二个以上具有独立的三级结构的多

48、肽 链（亚基），彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。亚基：具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位(subunit)。亚基聚合的驱动力：亚基间的疏水作用其它驱动力：离子键、氢键四级结构的性质实质是亚基在空间排列的方式。由相同亚基构成的蛋白质称为同聚蛋白质；由不同亚基构成的蛋白质称为杂聚蛋白质。由几个亚基构成的蛋白质称为寡聚蛋白质；由多个亚基构成的蛋白质称为多聚蛋白质亚基聚合的驱动力：亚基间的疏水作用其它驱动力：离子键、氢键四个亚基构成的杂聚蛋白质含2、2四个亚基血红蛋白血红蛋白结构寡聚蛋白质与多聚蛋白质的对称性多聚蛋白：病毒外壳多聚蛋白：病毒外壳多聚蛋白：病毒外壳小结：蛋

49、白质的结构层次从低到高可表示为：一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）超二级结构（相邻二级结构的聚集体）结构域（在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构）三级结构（球状蛋白质中所有原子在空间中的相对位置）四级结构（亚基聚合体）三、蛋白质分子中的共价键与次级键：立体构象的维持主要依靠次级键氢键离子键（盐键）疏水的相互作用（疏水键）配位键范德华力肽键和二硫键属于共价键第五节 蛋白质结构结构与功能 蛋白质分子具有多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。这不仅需要一定的化学结构，而且还需要一定的空间构象。研究蛋白质的空

50、间构象与生物功能的关系，已成为当前分子生物学的一个重要方面。但是蛋白质的空间构象归根到底还是决定于其一级结构和周围环境的影响，因此研究一级结构和功能的关系是十分重要的。一、一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能之间有密切关系。 1、种属差异目前对不同机体中表现同一功能的蛋白质的氨基酸排列顺序进行较详细的比较研究，发现种属差异是十分明显的。例如：分析、比较各种哺乳动物、乌类和鱼类等胰岛素的一级结构，发现绝大多数是由51个氨基酸组成的，其排列顺序大体相同，仅有细微差异。但是氨基酸残基的细微改变并不影响胰岛素的生物活性，或者说这些变化的氨基酸残基对胰岛素的生物活性并不起决定的作用。据研究，起决定作

51、用的是其一级结构中的相同部分，特别是二硫键对维持高级结构起着重要的作用，非极性氨基酸对维持蛋白质分子的高级结构也起着稳定的作用。同源蛋白质：不同生物体中执行同一功能的蛋白质。顺序同源现象：同源蛋白质的氨基酸顺序的相似性。种属差异：是生物进化的结果，不同种属间的同源蛋白质一级结构氨基酸差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。细胞色素c（Cytc）：脊椎动物104个氨基酸残基，昆虫 108 氨基酸残基，植物114个氨基酸残基，与人的Cytc的差异见右表，其中 28个位置上的氨基酸残基不随种属发生改变。一些生物与人的细胞色素C相差的氨基酸残基数目2、分子病现在知道，几乎所有遗传病都与蛋白质分

52、子结构改变有关，统称之为分子病。例如镰刀型贫血症，它是由于血红蛋白的-亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。分子病：由于遗传基因突变导致蛋白质分子结构的改变某种蛋白质的缺失所引起的疾病。镰刀型贫血症：HbA（链）: ValHisLeuThrProGluGluLysHbS（ 链）: ValHisLeuThrProValGluLys一级结构的细微变化导致蛋白质功能的丧失正常血红细胞镰刀状红细胞贫血仅仅由于这一点微细的差别，就使患者的红细胞在氧气缺乏时呈镰刀状，易胀破发生溶血，运氧机能降低，引起头昏、胸闷等贫血症状。

53、上述这些实例都说明，每种蛋白质分子都具有其特定的结构来完成它特定的功能。甚至只有个别氨基酸的变化就能引起功能的改变或丧失，证实了蛋自质结构与功能的相适应性，二者之间有高度统一性。小结：蛋白质一级结构决定高级结构，而特定的高级结构又与蛋白质的功能相适应，当一级结构改变有时会影响其功能；同源蛋白质的种属差异另一方面又说明有时一级结构相差很大的蛋白质又可能有相似的空间结构，执行相同的功能；而与功能相关的有关序列是高度保守的，当它们改变时蛋白质的结构改变，功能也随之丧失。二、蛋白质的空间结构与功能的关系蛋白质的构象并不是固定不变的。别构现象：当有些蛋白质表现其生物功能时，其构象发生改变，从而改变了整个

54、分子的性质，这种现象就称别构现象。别构现象是蛋白质表现其生物功能中的一种相当普遍而又十分重要的现象。如血红蛋白在表现其输氧功能时的别构现象。总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。第六节 蛋白质的性质蛋白质由氨基酸组成，因此蛋白质的性质有些与氨基酸相似，但也有其特殊的性质。一、蛋白质的相对分子质量蛋白质是相对分子质量很大的生物大分子，相对分子质量一般在100001000000之间或更大一些(表37)。测定蛋白质相对分子质量的方法，除了根据蛋白质的化学成分来测定外，主要还是利用蛋白质的物理化学性质来测定。主要方法有渗透压

55、法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法。其中渗透压法较简单，对仪器设备要求不高，但灵敏度较差。 最精确的方法是超离心法，但需要超速离心机。二、蛋白质的两性电离和等电点蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质，但它的两性电离比氨基酸复杂。蛋白质的等电点：对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正、负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。蛋白质在等电点处：电泳：带电粒子在电场的作用下向着所带

56、电性相反的电极移动的现象。溶液最不稳定溶解度最低，易沉淀粘度、渗透压、膨胀性、导电性均最小三、蛋白质的胶体性质蛋白质分子的颗粒直径在1-100nm之间，且分子量大，具有胶体特征如布朗运动、丁道尔现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力等。1、利用Pr不能通过半透膜的性质，可以通过透析法提取蛋白质。2、蛋白质是一种比较稳定的亲水胶体，因为其带有具极性的电荷 ，故亲水，且能形成一层水化膜，保持Pr分子。3、Pr分子在非等电状态下带有相同电荷易排斥，故不易沉淀。透析：利用大分子物质不能透过半透膜来分离大小分子的过程。透析装置天然生物膜：人工合成膜：如鸡蛋膜、细胞膜常见的半透膜材料：玻璃纸、火棉纸、羊皮纸（由噻璐珞、噻璐玢制成）四、蛋白质的沉淀作用使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。1、盐析2、有机溶剂沉淀法3、重金属盐沉淀4、生物碱试剂沉淀法5、弱酸或弱碱沉淀法1、盐析在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，