-吸光光度法.精品课件

1、-吸光光度法.第1页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日基本内容和重点要求掌握物质对光的选择性吸收、吸光度和透光度、朗伯比耳定律及摩尔吸光系数等知识；了解分光光度法的特点、基本原理、仪器构造和各部件的作用；学习显色反应和显色条件的选择；理解分光光度法定量分析中的各种影响因素。返回第2页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-1 紫外-可见吸光光度法概论一、方法依据及分类二、方法特点三、光的基本性质四、物质对光的选择性吸收返回第3页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日一、方法依据及特点基于物质对紫外-可见光的选择性吸收而建立起来的分析方

2、法(比色法、可见分光光度法及紫外分光光度法）。灵敏度高、选择性好 可测10-3-10-6molL-1准确度较高 相对误差为2%5%，满足微量分析要求应用广泛 可测定大多数无机物质及具有共轭双键的有机 化合物。仪器简单、操作简便、分析快速 一般不分离干扰物质就能测定返回第4页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日二、物质对光的选择性吸收单色光：具有同一波长的光复合光：不同波长组成的光可见光的波长大约在400760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。返回第5页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日 互补色

3、光 如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光，两种颜色互为补色。返回第6页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日物质颜色和吸收颜色的关系白光KMnO4紫色返回吸收黄绿色光白光CuSO4蓝色吸收黄色光第7页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日表7-1 物质颜色和吸收光颜色的关系物质颜色吸收光颜色波长范围/nm黄绿紫400450黄蓝450480橙绿蓝480490红蓝绿490500紫红绿500560紫黄绿560580蓝黄580600绿蓝橙600650蓝绿红650750返回第8页，共64页，2022年，5月20日，17点11

4、分，星期日 光吸收曲线（可用实验方法确定）400 450 500 550 600 650 /nmA0.80.60.40.2最大吸收波长max返回定性分析依据：不同物质具有不同吸收曲线形状和最大吸收波长（ max处灵敏度最高） 它描述了物质对不同光的吸收能力第9页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日 400 450 500 550 600 650 /nmA0.80.60.40.2max返回定量分析： max处吸光度大小不同浓度的同一物质， max不变，在吸收峰附近处的A随浓度增加而增大第10页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-2 光的吸收定律朗伯比耳

5、定律透光率与吸光度朗伯比耳定律吸光系数、摩尔吸光系数吸光度的加合性返回第11页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日1. 透光度T与吸光度AI0IrIaIt透光度或透射比吸光度Transmittance and Absorptivity返回平行单色光均匀第12页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日2. 朗伯比耳定律Lambert-Beers Law朗伯定律 A=lg = kb (c 一定时）比尔定律 A=lg = kc (b 一定时）A吸光度K比例常数，与吸光物质的性质、 入射光波长、温度等有关b液层厚度，cmc溶液的浓度，molL-1或g L-1返回I0

6、II0I合并第13页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日吸光系数、摩尔吸光系数吸光系数a：摩尔吸光系数：是吸光物质的吸光能力的量度 (大灵敏度高)关系： M acgL-1bcma=A/( b c)， Lg-1cm-1c mol L1bcm =A/(b c)，Lmol-1cm-1返回第14页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日朗伯比耳定律适用条件有色稀溶液、均匀,非散射的吸光物质 (气体和固体)入射光为垂直照射的平行单色光吸光物质间无相互作用被测物质不存在荧光或光化学现象第15页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日3. 吸光度的加合性多

7、组分体系中(各吸光物质无相互作用)返回第16页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-3 偏离朗伯比耳定律的原因标准曲线（校正曲线）非单色光引起的偏离化学因素引起的偏离介质不均匀引起的偏离返回第17页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日Standard curve，calibrated curve，working curve1. 标准曲线（校正曲线） A0.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10 mg/mL返回Ax（相同条件下测定）Cx固定b、I0和第18页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日A0

8、.500.400.300.200.100 2.0 4.0 6.0 8.0 10mg/mL正偏离负偏离返回第19页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日2.偏离比尔定律的原因（1）比尔定律的局限性 此定律只适用于稀 溶液（假设吸收离子之间无相互作用）。 高浓度时，粒子间的距离缩小，相互作用力增大，改变粒子对光的吸收能力，使 A 与 C 之间的线性关系发生偏离。第20页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日（2） 非单色光引起的偏离目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光，物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比耳定律的偏离（仪器条

9、件限制）。克服非单色光引起的偏离的措施：使用比较好的单色器；入射光波长选择在被测物质的最大吸收处（灵敏度最高，线性关系最好）；测定时应选择适当的浓度范围。返回第21页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日（3）化学因素引起的偏离溶液中的吸光物质常因解离、络合、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯比耳定律。在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比耳定律的偏离。返回第22页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日Cr2O72- + H2O2HCrO42-2CrO42-+H+橙色黄色Cr

10、的总浓度相同时，A 取决于C(Cr2O72-)/C(CrO42-)之比值加酸或加碱，使C与A之间符合L-B定律 max=375nm max=350nm第23页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日4. 介质不均匀引起的偏离 溶液不均匀时，入射光通过溶液后，有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲（正偏离）。 在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。 返回第24页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日分光光度计及其基本部件一、基本部件及性能光源单色器吸收池检测系统读数指示器返回第25页，共64页，2022年，5月20

11、日，17点11分，星期日1. 光 源 在可见光和近红外光区，常用钨灯或碘钨灯作光源，它们辐射3601100nm波长的光（要求：光源发出所需波长范围内的连续光谱具有足够的光强度，并稳定）； 在近紫外区，常使用氢灯或氘灯，它们能辐射180375nm波长的光。光源单色器检测系统吸收池返回第26页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日2. 单色器 由色散元件（将光源发出的连续光谱分解为单色光的元件）、入射狭缝、出射狭缝和准射镜组成。常用的色散元件：棱镜或光栅。 棱镜：用光学玻璃或石英制成，光通过棱镜发生折射而色散，按波长顺序将复合光分解为单色光。 光栅光通过光栅发生衍射和干涉现象而分

12、光。 优点：波长范围宽、色散均匀、分辨率高 缺点：各级光谱重叠相互干扰，可用适当滤光片消除返回第27页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日3. 吸收池 也称比色皿，用于盛吸收溶液的液槽； 由无色透明的光学玻璃或石英制成； 液层厚度为0.5、1、2、3cm等的一套长方形或圆柱形比色皿。注意放置位置及光洁光源单色器检测系统吸收池返回第28页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日4. 检测系统 是一种光电转换元件，将光能转换为电流进行测量。常用的光电转换器：硒光电池或光电管硒光电池：当光照射时，硒电池表面就有电子逸出，能产生10100A的光电流，对光的敏感波长范

13、围300800nm。 特点：结构简单，便宜，更换方便，长时间使用会出现疲劳现象(照射光强度不变而产生的光电流逐渐下降）。返回第29页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日 光电管：由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空 二极管。 由于阴极材料光敏性能不同，分为红敏（使用波长为6251000nm）和蓝敏（波长范围200625nm）；光强相同时所产生的电流约为光电池的1/4。 特点：易放大、灵敏度高、光敏范围广、不易疲劳。第30页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日常见的分光光度计紫外分光光度计第31页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日第32

14、页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-5 显色反应及显色条件的选择一、显色反应的要求二、显色反应的选择三、显色条件的选择四、显色剂返回第33页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日一、显色反应（ Color reaction ）的要求 显色反应：待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。 按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和配位反应两大类，而配位反应是最主要的。返回第34页，共64页，2022年，5

15、月20日，17点11分，星期日显色反应的要求灵敏度高，有色物质的应大于104；选择性好，干扰少，或干扰容易消除；有色化合物的组成恒定，化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定；显色剂在测定波长处无明显吸收，即显色剂对光的吸收与配合物的吸收有明显区别，要求两者的最大吸收峰波长之差（称为对比度）大于 60 nm。 返回第35页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日二、显色条件的选择显色剂用量酸度显色温度显色时间干扰的消除溶剂返回第36页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日1. 显色剂的用量M + R = MR （被测组分） （显色剂） （有色配合

16、物） 为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。如： Mo(SCN)32+ Mo(SCN)5 Mo(SCN)6- 在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。返回SCN-浓度过低SCN-浓度过高红色浅红色浅红色第37页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日cA0cA0cA0123返回C 为显色剂的浓度CaCa CbCb第38页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日2. 酸 度R + H+ HR影响显色剂的平衡浓度（影响显色反应）和颜色影响被测金属离子的存在状态(酸度低时易水解）影响配合物的组成 ,

17、 如：Fe3+ssal制作pH与吸光度关系 曲线确定pH范围。 pHA0返回pH=23 , Fe(ssal)红紫色pH=47, Fe(ssal)2棕橙色pH=810, Fe(ssal)3黄色第39页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日3. 显色温度显色反应大多在室温下进行，有些显色反应需加热至一定温度完成；如：磷钼蓝法测磷，发色温度为5560。有些有色物质温度偏高时易分解；适当温度选择：制作温度与吸光 度关系曲线确定稳定显色温度范围。返回t/A0第40页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日4. 显色时间 有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳 定状态，

18、并在较长时间内保持不变； 有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色； 有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定； 适当时间选择：制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。返回第41页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日tA0tA0tA0123返回t1t2t1t2第42页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日5. 干扰物质的影响及消除干扰物质的影响： 干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在 测量条件下也有吸收，造成正干扰； 干扰物质与被测组分反应，使显色反应不完全，也会造成干扰； 干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶

19、液的吸光度。返回第43页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日干扰的消除加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子形成无色络合物或无色离子（如测Co2+时，Fe3+有干扰，加入NaF消除）；选择适当的显色条件以避免干扰（控制pH值，如用ssal测Fe3时，Cu2+有干扰，控制pH=2.5时消除其干扰)；选择适当的光度测量条件(如max等）；分离干扰离子（采用沉淀法、离子交换法、溶剂萃取法等）。 返回第44页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日6. 溶 剂 有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深；

20、还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。返回第45页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日四、显色剂无机显色剂有机显色剂返回第46页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日1. 无机显色剂无机显色剂不多，因为生成的配合物不稳定，灵敏度和选择性也不高，目前应用不多。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒等。返回第47页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日2. 有机显色剂有机显色剂分子中含有生色团和助色团。生色团（chromophoric group）：含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中

21、的电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的光而显色。助色团（auxochromic group）：含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。助色团与生色团的不饱和键作用，使颜色加深。 返回第48页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日常用有机显色剂磺基水杨酸：OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。丁二酮肟：NN型螯合剂，用于测定Ni2+。1,10-邻二氮菲：NN型螯合剂，测微量Fe2+。返回第49页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-6 吸光度测量条件的选择一、入射光波长的选择二、参比溶液的选择三、吸光度读数

22、范围的选择返回第50页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日一、入射光波长的选择“最大吸收原则”（maximum absorption）不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离。“吸收最大、干扰最小” 在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时选择非最大吸收处的波长，以消除干扰。返回第51页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日A/nm012A/nm012返回第52页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日二、参比溶液的选择 参比溶液的作用：调节仪器零点，消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰。返

23、回第53页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日参比溶液的选择蒸馏水/纯溶剂：试液中其它组分及显色剂 均无吸收。不加显色剂的被测试液：显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子。不加试样溶液的试剂空白：显色剂有颜色。当干扰物与显色剂也发生反应时，加适当掩蔽剂掩蔽被测组分，使之不再与显色剂作用，然后加入显色剂,作为参比溶液。第54页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日三、吸光度读数范围的选择从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.20.8范围内。可通过控制溶液的浓度（如改变试样的取样量或改变显色体系的体

24、积）或选择不同厚度的吸收池来达到目的。 返回第55页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日7-7 吸光光度法的应用示例返回 用于常量组分和多组分的测定，在生物学中用于生物成分的鉴定和结构的研究。如蛋白质、氨基酸的测定，酶的结构、作用机理及活性的测定。第56页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日pH=5显色，max508nm，1.1104Lmol-1cm-1返回采用标准曲线法如：铁的测定一、单组分的测定第57页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日硅钼蓝法测定微量SiO2pH 0.52显色，提高温度可加快硅钼黄形成（室温下需10min完成，沸水浴中30秒即可），max810nm，通常在620660nm测定。PO43-、AsO43-有干扰（F-）返回第58页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日钛的测定（H2O2法）H2SO4介质显色，max410nm，720Lmol-1cm-1干扰：Fe3+H3PO4V 、W、 Mo 、U有干扰，但一般样品中不存在。返回第59页，共64页，2022年，5月20日，17点11分，星期日例1. 符合朗白比尔定律的有色溶