核酸的研究方法课件

1、核酸的研究方法课件核酸的研究方法课件第一节 核酸的分离、提纯和定量测定第一节 核酸的分离、提纯和定量测定核酸制备的原则核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和变性，要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。 核酸制备的原则核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和一、DNA的分离 1. 浓盐法：SDS-浓盐buffer破碎细胞离心，取上清加水，使DNP沉淀酚/氯仿去蛋白，纯化一、DNA的分离 1. 浓盐法：SDS-浓盐buffer破碎二、RNA的分离 制备RNA通常需要注意3点：所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，

2、塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。二、RNA的分离 制备RNA通常需要注意3点：常用的制备RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA。（2）分离方法：用异硫氰酸胍苯酚氯仿抽提。（3）分离poly(A) mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo

3、(dT)亲和层析法 常用的制备RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于细胞的不同三、核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm）2.定磷法先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量 三、核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm）3.定糖法（1）当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm），反应需要三氯化铁作催化剂 （2）DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595 nm处 3.定糖法第二节 核

4、酸的凝胶电泳第二节 核酸的凝胶电泳常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺 一、琼脂糖凝胶电泳 常用于分析DNA和RNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等 ；电泳完毕后，将胶在荧光染料溴化乙锭的水溶液中染色 ；经紫外光照射可发射出红橙色荧光 一、琼脂糖凝胶电泳 常用于分析DNA和RNA。由于琼脂糖制琼脂糖凝胶电泳的应用1. 可以确定是否存在核酸物质。2.可以近似测定DNA片段的分子大小和含量3.凝胶上

5、的样品可以回收，以供进一步研究 2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp琼脂糖凝胶电泳的应用1. 可以确定是否存在核酸物质。2000二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1 000 bp的DNA片段和RNA的电泳。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，第三节 核酸的核苷酸序列测定 第三节 核酸的核苷酸序列测定 一、酶法测序 Sanger于1975年设计，又称为“加减法” 工作原理：先随机合成片段，然后除去4种dNTP分为8份只加一种

6、一、酶法测序 Sanger于1975年设计，又称为“加减法”PAGE胶电泳ATGCTGTACGACTACGACTACGTACGTATGCTGTACGATACGATATATA对照-C -T -A -G +C +T +A +GPAGE胶电泳ATGCTGATGCTG对照-C 1977年Sanger又提出了 “终止法”共分4组，每组按一定比例加入一种2，3双脱氧核苷三磷酸；能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成即终止 ；经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列 1977年Sanger又提出了 “终止法”二、DNA的化学法测序 化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。基本

7、原理：用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 二、DNA的化学法测序 化学法测序由Maxam和Gilbe 4组特异的反应如下：(1) G反应 用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。(2) G+A反应 用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。(3) T+C反应 用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。(4) C反应 当有盐存在时

8、，只有C与肼反应，并被哌啶除去。哌啶促使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂。 4组特异的反应如下：第四节 DNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction; PCR) 第四节 DNA聚合酶链反应(polymerase c聚合酶链式反应(PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到106倍，可从极微量的DNA乃至单细胞含有的DNA起始，扩增出ug级的PCR产物。自20世纪80年代中期PCR技术问世以来，迅速渗透到了分子生物学的各个领域，现已在基因克隆、外源基因的整合检测、物种起源、生物进化等方面得到了广泛应用。聚合酶链式反应(PCR)是利用单