选修1DNA的粗提取与鉴定 完整版PPT

1、专题5 课题1 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。生物大分子：主要指蛋白质、酶、DNA、RNA。 2、提取DNA的基本思路： 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。3、DNA的溶解性： DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。（1）DNA在NaCl溶液中的溶解性：一、基础知识（一）提取DNA的方法3、DNA的溶解性

2、：【思考】： 在什么浓度下， DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是 如何变化的？（1）DNA在NaCl溶液中的溶解性：一、基础知识（一）提取DNA的方法 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。3、DNA的溶解性：【思考】：（1）DNA在NaCl溶液中的溶解性：一、基础知识（一）提取DNA的方法 如何通过控制 NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大(使

3、DNA充分溶解，而使杂质析出）； 当氯化钠的物质的量浓度为 0.14 molL时，DNA的溶解度最小(使DNA析出，而使杂质溶解）。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。过低溶低析高溶3、DNA的溶解性：一、基础知识（一）提取DNA的方法（2）DNA在酒精溶液中的溶解性： DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。一、基础知识（一）提取DNA的方法4、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞的细胞膜，去

4、除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。一、基础知识（二） DNA的鉴定 在沸水浴的条件下， DNA遇二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 二、实验设计（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（三）去除滤液中的杂质（四） DNA的析出与鉴定二、实验设计（一）实验材料的选取 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）。 2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。1、动物细胞鸡血细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液

5、二、实验设计制备鸡血细胞液1、动物细胞鸡血细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液二、实验设计动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。破碎细胞1、动物细胞鸡血细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液二、实验设计P55为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。2、植物细胞洋葱细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液二、实验设计 提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行

6、从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。P55加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜,有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。2、植物细胞洋葱细胞（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液二、实验设计 提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。P55 如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等二、实验设计（三）去除滤液中的杂质二、实验设计（三）去除滤液中的杂质P

7、55此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质?答：用高浓度的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高浓度的NaCl溶液中不能溶解的杂质；用低浓度NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低浓度NaCl溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。二、实验设计（三）去除滤液中的杂质P55DNA的析出用的是与滤液

8、体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ）,静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。1、DNA的析出（四） DNA的析出与鉴定二、实验设计2、 DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入丝状物,各加入二苯胺4ml试剂.混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。二、实验设计（四） DNA的析出与鉴定这一鉴定结果说明：提取出的丝状物是DNA。 观察提取的DNA颜色，如

9、果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误，需要重新制备。（一）是否提取出了DNA三、结果分析与评价（二）分析DNA中的杂质 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（三）不同实验方法的比较鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图2mol/L鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图5、过滤取纱布上的滤物纱布过滤6、再次溶解DNA2mol/LNaCl溶液取滤物鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图7、加冷酒精使DNA析出（纯化）冷酒精鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图DNA的鉴定DNA的

10、粗提取与鉴定实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应DNA粗提取选择适宜材料破碎细胞DNA的溶解和析出DNA的纯化鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应总结：1. 下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是 A氯化钠的浓度越低，对DNA的溶解度越大 B人血也可代替鸡血进行实验 C柠檬酸钠的主要作用是加速血细胞破裂 DDNA不能溶于酒精2. 在破碎鸡血细胞时，要先加入20ml的蒸馏水，其作用是A. DNA溶解于水 B 血细胞破裂，DNA释放C稀释血液，防止凝固 D 有利于搅拌3.

11、 若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐，加入食盐的目的是A. 利于DNA的溶解 B. 分离DNA和蛋白质C. 溶解细胞膜 D. 溶解蛋白质4. 在DNA粗提取实验中，向在溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是A有利于溶解DNA B有利于溶解杂质C减少DNA的溶解度 D减少杂质的溶解度再见 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（二）分析DNA中的杂质（三）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二

12、苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好8、DNA的鉴定 DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 紫外灯照射法A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色C、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)甲基绿 （蓝绿色）（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取四、实验案例鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因鸡血

13、细胞核的DNA含量丰富，材料易得2、实验原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。3、实验材料和用具：鸡血细胞液（510ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0g/ml的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分别为2mo

14、l/L和0015mol/L的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。 4、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底

15、部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）过程柠檬酸钠作用防止血液凝固作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液注意事项讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 m

16、in，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均

17、匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）析出含DNA的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3

18、中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上将DNA的粘稠物再溶解取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸

19、吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 DNA的鉴定讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2）这一鉴定结果说明

20、什么问题？（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的 答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”6、讨论：两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层三次过滤第一次： DNA存在于滤液里 第一步第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步两次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多第三步第二次：用冷却的95的酒精第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA（2）为什么反复地溶解与析