多聚酶链式反应扩增DNA片段课题

1、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术)，是一个在体外快速扩增特定基因或DNA序列方法，故又称为DNA体外扩增技术。 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第1页温故知新1:组成DNA分子基本单位是什么?这些基本单位是怎样连接成DNA分子?DNA分子结构有什么特点？多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第2页12345DNA基本单位脱氧核苷酸多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第3页OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖53脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第

2、4页ATGCAGCTDNA分子平面结构氢键5端3端5端3端多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第5页DNA分子复制过程是怎样？DNA分子复制需要哪些条件？温故知新2多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第6页DNA母链：提供复制模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物3端开始连接脱氧核苷酸DNA复制条件多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第7页复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNA复制方向DNA合成方向总是从子链5端向3端延伸多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第8页1、 DNA聚合酶特征不能从头合成

3、DNA，只能从DNA3端开始延伸DNA链，所以， DNA复制需要引物2、 DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链经过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物3端开始延伸DNA链， DNA合成方向总是从子链5端向3端延伸一、基础知识（一）PCR原理：多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第9页多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第10页在80100温度范围内， DNA双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性3、 PCR原理当温度迟缓降低后，两条彼此分离DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA热变性原理，经过控制温度来控制双链解聚与结合，现在使用PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度仪器多聚酶

4、链式反应扩增DNA片段课题第11页多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第12页高温处理了打开双链问题，不过，又造成DNA聚合酶失活问题，耐高温Taq DNA聚合酶处理了高温造成DNA聚合酶失活问题，促成了PCR技术自动化4、 Taq DNA聚合酶应用5、 缓冲液需要为PCR反应提供物质DNA模板，分别与两条模板链相结合两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热DNA聚合酶，同时经过控制温度使DNA复制在体外重复进行多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第13页PCR技术是80年代中期发展起来体外核酸扩增技术。 它含有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术特点多聚酶链式反应扩增

5、DNA片段课题第14页 PCR过程需要引物是RNA或DNA，而是人工合成DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸7、细胞内复制和PCR不一样点 PCR过程中DNA解旋不依靠解旋酶，而是经过对反应温度控制来实现多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第15页细胞内DNA复制PCR不一样点解旋解旋酶，边解旋边复制80100高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高温子链合成一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成相同点需要提供DNA复制模板四种脱氧核

6、苷酸作为原料子链延伸方向都是从5端到3端细胞内DNA复制与PCR比较多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第16页PCR技术原理总结利用DNA分子热变性原理，经过控制温度来控制双链解旋与结合，从而完成体外DNA分子扩增。体外DNA复制条件：四种脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度温控设备。复制方向：子链5端向 3端延伸。多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第17页（二） PCR反应过程1、PCR反应步骤PCR普通经历三十屡次循环，每次循环能够分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成

7、双链DNA解离，使成为单链，方便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第18页靶序列靶序列PCR 循环第一步 ：加热变性多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第19页复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右， 引物与模板DNA单链互补序列配对结合多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第20页靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第21页延伸DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配正确标准与半保留复制原理，合成一条新DNA链

8、多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第22页靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循环第三步 ：引物延伸多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第23页靶序列 靶序列第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝靶序列多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第24页多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第25页3、30次循环后靶序列扩增数量循环次数DNA数量1 22 43 820 1,048,57630 1,073,741,824多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第26页二、PCR反应过程小结5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/多聚酶链式反应扩

9、增DNA片段课题第27页5引物15引物2第二次复制第一次复制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循环（复制）后，模板DNA含量能够扩大100万（220）倍以上。多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第28页每个循环包含：变性 复性延伸从第二轮循环开始，上一次循环产物也能够作为模板参加反应，而且由引物延伸而成DNA单链会与引物结合，进行DNA延伸，这么，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间DNA序列，使这段固定长度序列呈指数扩增。PCR反应过程：多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第29页PCR反应条件： 稳定缓冲液环境 DNA模板 分别与两条模板链相结合两种引物 A、T

10、、G、C四种脱氧核苷酸 耐热DNA聚合酶，普通用TaqDNA聚合酶 能严格控制温度改变温控设备多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第30页三、 PCR 试验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度仪器2、微量离心管一个薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中液体，其上一次性吸液枪头用一次更换一次多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第31页PCR仪多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第32页微量离心管微量移液器多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第33页1、准备2、移液（二）试验操作步骤按照PCR反应体系配方将所需用试剂摆放在试验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配

11、方往微量离心管里面加入各种试剂多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第34页过程：盖严微量离心管口盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管管壁，目标是使反应液混合均匀。A、离心管口盖子一定盖严，预防试验中脱落或液体外溢。多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第35页将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应离心目：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第36页PCR三步曲 预变性保温 变 性94 30s延伸 721min复性 5530s94 5min多聚酶链式反应扩增DNA片段

12、课题第37页循环数变性复性延伸预变性94，5min30次94，30s55，30s72，1min最终一次94，1min55，30s72，1min多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第38页PCR技术高度灵敏，为了防止外源DNA等原因污染而造成干扰试验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；PCR所用缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上迟缓融化。分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第39页（一）理论上DNA扩增数目计算四、课题结果评价1 、一条DNA，

13、复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）试验中DNA含量测定1 、原理能够经过计算DNA含量来评价扩增效果，DNA在260nm紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与DNA含量相关多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第40页稀释2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调整至零测定取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处光吸收值计算DNA含量（ g /ml ）50 (260nm读数）稀释倍数2.过程多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第41页多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第42页比色杯多聚酶链式反应扩增DNA片段课题第43页五、试验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段基因拷贝数放大一倍,普通样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72多聚酶链式反应扩增DN