低产高级醇工业上面发酵酵母的选育

1、PAGE PAGE - 5 -低产高级醇工业上面发酵酵母的选育啤酒是以酒花和麦芽汁为原料,由啤酒酵母酿制而成的酒精饮料1。酵母代谢产生的风味物质决定了啤酒的感官特性。根据风味物质的化学属性,可将其分为醇类、醛类、酸类、酯类、酮类、内酯类化合物、缩醛类化合物、吡嗪类化合物、呋喃类化合物、芳香族化合物、硫化物等2-3。其中,高级醇是指3个或3个以上碳原子的醇类的统称,同时也称为杂醇油1,是啤酒中重要的风味物质,主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、苯乙醇4-5。啤酒中高级醇的含量一般为70100 mg/L,而优质啤酒对高级醇含量的控制更为严格,通常在5090 mg/L6。适量的高级醇能赋予啤酒

2、独特的香味,含量过低,酒体不丰满,口感较差;但含量过高时,不仅会影响酒体的协调性,还会对饮用者的身体产生明显的副作用7-9。啤酒高级醇含量过高是业内普遍存在的问题,如何将高级醇含量控制在合理范围对于提升啤酒品质具有重要的意义。目前,高级醇的调控主要有两种手段：一是通过原辅料、发酵温度、溶氧量等指标调控来优化发酵工艺；二是从发酵菌种出发,通过选育低产高级醇的优良酵母菌株从根本上降低高级醇含量。近年来,随着对诱变技术的深入研究,由清华大学邢新会研究团队自主研发的常压和室温等离子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术已经成为了一种新型的育

3、种方法。与传统的诱变技术相比,此项技术具有操作简便、安全性高、高通量诱变、高总突变率和正向突变率高的特点10,已经广泛应用于细菌、真菌、微藻等多种微生物的改造11-15。筛选过程是选育低产高级醇酵母菌株的关键限速步骤。传统的摇瓶发酵筛选方法虽然准确度较高,但操作繁琐、周期长、工作量大,无法做到菌株的快速筛选16。近年来,高通量筛选得到了快速发展。研究表明,分光光度法可以实现高级醇含量的快速检测17。此外,微孔板的高通量筛选技术在菌株筛选方面也取得了良好的效果,提高了筛选效率18-19。这些均为低产高级醇酵母菌株的高通量筛选提供了新的策略。本研究以工业酵母(Saccharomycescerevi

4、siae)680bg为出发菌株,利用ARTP诱变技术对其菌悬液进行处理,运用微孔板培养法结合分光光度法,建立高通量筛选方法,以期筛选低产高级醇菌株,为啤酒酵母的选育提供依据。2.4 诱变菌株复筛由于比色法只能粗略地检测高级醇的含量,且此法受温度等因素的影响较大,难免会产生一定的偏差,为了更加精确地筛选出低产高级醇菌株,需要对51株初筛菌株与出发菌株680bg进行发酵验证。2.4.1 高级醇含量比较采用1.2.2介绍的发酵工艺培养菌株7 d,取发酵液离心、蒸馏,用气相色谱技术检测诱变菌株与出发菌株高级醇含量。结果如表1所示,经过诱变、反复筛选,共得到了8株低产高级醇菌株,其中,ARTP-162菌

5、株产生的高级醇含量是所有菌株中最低的,与出发菌株相比降低了约21%,其他的诱变菌株(ARTP-5、ARTP-12、ARTP-32、ARTP-65、ARTP-109、ARTP-113、ARTP-129)的高级醇含量也较出发菌株分别降低了14.3%、12%、11.25%、9.9%、12.1%、12.8%、11.1%。表1 诱变菌株与出发菌株高级醇含量 单位：mg/LTable 1 Comparison of higher alcohol contents between mutated strain and the original strain2.4.2 基本理化指标比较待发酵结束后,对所有菌株

6、的酒精度、真正发酵度及发酵力等理化指标进行测定、分析。如表2所示,与出发菌株680bg相比,诱变菌株无论是在CO2释放量、酒精度还是真正发酵度上,均没有发生明显的变化。这意味着这些诱变菌株不仅具有低产高级醇的特性还保留了良好的发酵性能。表2 出发菌株680bg及诱变菌株的基本发酵性能Table 2 Fermentation performances of original strain 680bg and mutated strain2.5 诱变菌株遗产稳定性检测通过连续传代实验,对菌株ARTP-162的遗传稳定性进行了分析。如图5所示,随着传代次数的增加,诱变菌株ARTP-162的产高级醇能力、酒精度、真正发酵度及CO2生成量等基本发酵性能并没有发生大变化,直至第八代也基本维持稳定,这表明诱变菌株ARTP-162遗传性能稳定,可用于工业化生产。a-传代次数对菌株高级醇产量的影响；b-传代次数对菌株酒度、发酵度及总失重的影响图5 诱变菌株的遗传稳定性分析Fig.5 Analysis of genetic stability of mutagenic strain3 结论ARTP离子诱变是一种新型有效的诱变育种方法。本研究以菌株680bg为出发菌株,运用ARTP离子诱变手段对其进行诱变处理,经48孔板培养后用高级醇分光光度法快速检测菌株的高