06细胞工程制药

1、06 细胞工程制药S1 动物细胞制药概述S2 动物细胞的培养技术S3 动物细胞制药的前景S4 植物细胞制药S1 动物细胞制药概述细胞与细胞工程动物细胞工程应用于制药细胞与细胞工程1665年，Hooke发现死细胞的细胞壁1674年，Leeuwenhoek首次观察到活细胞1838 & 1839年，Schleiden & Schwann独立提出了“细胞学说” 细胞工程的理论基础细胞与细胞工程细胞工程：是以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行设计和操作，使细胞获得新的遗传特性，并在离体条件下进行大量培养和增殖，生产所需产品。动物细胞工程：就是指按照人们预定的设计，根据细胞生

2、物学及工程学原理定向改造动物细胞的遗传性，并用于生产相关产品。细胞与细胞工程直接对细胞进行操作：1、细胞水平：细胞融合、胚胎移植、 单克隆抗体技术、细胞大规模培养技术 人工受精、试管婴儿技术 2、亚细胞水平：核移植、细胞器转移3、染色体水平：染色体转移、改造4、基因水平：基因转移、改造动物细胞工程应用于制药1949年，Enders的一篇报告，为以后采用细胞培养技术生产疫苗奠定了基础随着基因工程的发展，人们认识到许多基因工程产物翻译后的修饰、正确的切割、折叠的必要性，动物细胞成为一种重要的宿主细胞动物细胞工程应用于制药目前，动物细胞已用于生产疫苗、干扰素、白细胞介素、EPO等各种基因工程药物大肠

3、杆菌：表达的基因重组生物技术药物有18种，都是结构相对简单、分子量较小的蛋白质，主要为细胞因子类药物。酵母：表达的基因重组生物技术药物有8种，表达的蛋白可以正确折叠，分子量较大、结构较复杂。哺乳动物细胞：表达或生产的生物技术药物有53种，都是分子量大、二硫键多、空间结构复杂的糖蛋白。动物细胞工程应用于制药目前，动物细胞已用于生产疫苗、干扰素、白细胞介素、EPO等各种基因工程药物美国FDA在2000年后批准的创新生物技术药物，用大肠杆菌表达的产品只有4种，用酵母表达的只有2种，而通过动物细胞培养生产的产品则有22种。哺乳动物细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面仍将持续并且其所占

4、比例有逐年扩大趋势。动物细胞工程应用于制药另一个方向：转基因动物制药 （天然的生物反应器） 07转基因动植物制药S2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细胞培养基动物细胞大规模培养的方法动物细胞的形态动物细胞的形态按照生长时的贴壁性，细胞可分为：贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞贴壁细胞贴附在支持物表面生长，需贴附因子1、成纤维样细胞型（fibroblast-like cell type） 来源于中胚层组织的细胞如：成纤维细胞 心肌细胞 平滑肌细胞 成骨细胞贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞贴壁细胞呈梭形或不规则的三角形中央有圆形核胞质向外伸出2-3个突起

5、 细胞群常借助这些突起连接成网，生长时呈放射状、漩涡状或火焰状贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞1、成纤维样细胞型贴壁细胞贴附在支持物表面生长，需贴附因子2、上皮样细胞型（epithelium-like cell type） 来源于外胚层和内胚层组织的细胞如：皮肤细胞 肠管上皮细胞 肺泡上皮细胞贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞贴壁细胞呈扁平的不规则多角形中央也有圆形核生长时彼此紧密连接成单细胞层贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞2、上皮样细胞型贴壁细胞贴附在支持物表面生长，需贴附因子1、成纤维样细胞型（FLC type） 2、上皮样细胞型（ELC type）细胞形态不是绝对的，随培养条件变化贴壁细胞悬浮细胞兼

6、性贴壁细胞悬浮细胞生长不依赖支持物表面，可在培养液中悬浮生长，细胞呈圆形例如：血液内的淋巴细胞、用于生产干扰素的Namalwa细胞等贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞不严格依赖支持物，贴附生长时：呈上皮或成纤维细胞的形状悬浮生长时：呈圆形例如：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）（chinese hamster ovary）贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞CHO-K1贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞原代细胞二倍体细胞系转化细胞系通过某个转化过程形成异倍体转化：自发（多见于啮齿动物）、人工诱发（病毒或化学试剂）、利用肿瘤组织特点：具有无限增殖的能力，倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，

7、更适合大规模工业化生产的需要S2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细胞培养基动物细胞大规模培养的方法动物细胞的生理特点1、分裂周期长：12-48hG1期（DNA合成前期）：4-5hS期（DNA合成期）：6-8hG2期（DNA合成后期）：2-5hM期（细胞分裂期）：仅0.5-1h动物细胞的生理特点2、一般需贴附于基质，并有接触抑制现象贴附生长：电荷作用、钙镁离子、贴附因子（如胶原、纤维结合蛋白）接触抑制：在基质上分裂增殖，每个细胞都与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖；但是当细胞转化为异倍体后，接触抑制现象消失动物细胞的生理特点3、正常二倍

8、体细胞的生长寿命有限几个概念原代培养：次代培养：直接从组织中分散的细胞进行培养将原代培养物转移到新鲜培养基上培养动物细胞的生理特点3、正常二倍体细胞的生长寿命有限有限细胞系：无限细胞系： 由原代培养产生，只能进行有限的传代，决定于细胞来源的种族和年龄 细胞经转化后变成异倍体，具有无限增殖的能力，适合于工业化生产细胞系：由原代培养产生的、或转化产生的细胞群动物细胞的生理特点4、对周围环境十分敏感 对各种物理化学因素（如渗透压、PH、离子浓度、剪切力、微量元素等）的变化耐受力很弱 原因：没有细胞壁，影响脂质和蛋白质分子的因素都会影响细胞膜，并影响动物细胞的存活动物细胞的生理特点5、对培养基的要求高

9、 需要葡萄糖作为碳源、12种必需氨基酸、8种以上维生素、多种无机盐和微量元素 需要多种细胞生长因子和贴壁因子等才能生长，且随细胞种类的不同而不同动物细胞的生理特点6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同游离核糖体胞内蛋白粗糙内质网核糖体胞外或膜蛋白， 且多经糖基化S2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细胞培养基动物细胞大规模培养的方法生产用动物细胞的获得原代细胞二倍体细胞系转化细胞系原代细胞直接取自动物组织、器官制成细胞悬液不能完全形成单细胞，且某一组织常由多种细胞组成生产中需要大量的动物，费钱，费劳力常用：鸡胚细胞、兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴

10、细胞二倍体细胞系从原代细胞纯化出一定的细胞株具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性有限的增殖能力，50代无致瘤性一般均从动物的胚胎组织中获得，如： WI-38、MRC-5、2BSMRC-5转化细胞系通过某个转化过程形成异倍体转化：自发（多见于啮齿动物）、人工诱发（病毒或化学试剂）、利用肿瘤组织特点：具有无限增殖的能力，倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适合大规模工业化生产的需要常见：Namalwa、CHO-K1、BHK-21、VeroCHO-K1BHK-21uninfectedinfectedS2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细

11、胞培养基动物细胞大规模培养的方法动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒2、保证良好的水质3、PH值去除有害因子，防污染经特殊处理最适为7.2-7.4；使用缓冲体系动物细胞的培养条件4、渗透压5、温度6、空气最适290-300mOsm/kg；NaCl调节；平衡盐最适370.5oC足够的氧气；常采用不同比例的O2、N2、CO2和空气S2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细胞培养基动物细胞大规模培养的方法动物细胞培养基天然培养基合成培养基无血清培养基天然培养基早期阶段：多采用天然培养基常用：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等缺点：1、培

12、养基成分复杂，组分不稳定，2、来源有限因此不适合大量培养和生产的需要合成培养基1950年，Morgan等首先采用成分明确的化学试剂配制培养基，开创了合成培养基的研究使用阶段优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应组成：糖类、氨基酸、维生素、无机盐、核酸前体等尚需添加成分：动物血清（如5-10%的小牛血清）合成培养基可能的机制：1、提供有利于细胞生长所需的各种生长因子和激素2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和延伸因子3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素5、提供良好的缓冲体系无血清培养基无血清培养基：在合成培养基（未添加动物血清）内加入不同种类

13、的添加剂：1、激素和生长因子：如胰岛素促进糖原和脂肪酸合成，并刺激细胞生长2、结合蛋白：如铁传递蛋白和白蛋白；为了便于纯化，可改用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁3、贴附因子和延伸因子4、其他有利于细胞生长的因子和元素无血清培养基无血清培养基的优点：1、提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次间差异的影响 2、减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染 3、避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性 4、减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析5、供应充足、稳定，产品易于纯化 S2 动物细胞的培养技术动物细胞的形态和生理特点生产用动物细胞的获得动物细胞的培养条件动物细胞培养基

14、动物细胞大规模培养的方法动物细胞大规模培养的方法悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养悬浮培养适用：所有非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验不足：细胞密度较低悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养悬浮培养设备：通气搅拌罐式生物反应器悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养类似于细菌发酵罐，但由于动物细胞的特性，具体要求又有所不同：1）低速搅拌：20-100rpm2）高径比小：1-1.5 ：1 （微生物：2-3：1）3）无气泡通气系统悬浮培养设备：气升式生物器（Airlift Bioreactor）悬浮培

15、养贴壁培养贴壁-悬浮培养悬浮培养设备：搅拌瓶（spinner flask） 简易的实验室规模，最大10L悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养小常识：培养规模的划分实验室规模（lab scale）中试规模（pilot scale）生产规模（industrial scale）100L：生产和提供产品这种划分不是绝对的，还需根据细胞的产量和临床用药剂量的大小而定。贴壁培养适用：所有贴壁细胞和兼性贴壁细胞优缺点恰好与悬浮培养相反 贴壁培养与悬浮培养的一个重要不同：传代或扩大培养时，常需要用酶使细胞间质和一些贴附因子水解，使细胞从基质分离成单细胞。悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养细胞密度高；操作复杂贴壁培养悬浮

16、培养贴壁培养贴壁-悬浮培养 设备：转瓶（roller bottle） 早期大量培养原代鸡胚或肾细胞生产疫苗， 后来引入了计算机自动控制。贴壁培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养 设备：转瓶（roller bottle）贴壁培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养 设备：固定床式生物反应器（fixed bed bioreactor）（hollow-fiber bioreactor）贴壁培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养 设备：中空纤维式生物反应器（membrane bioreactor）贴壁培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养 设备：膜式生物反应器10个内腔，每个表面积600cm22L培养液 = 6000

17、cm2的转瓶，12.5L聚苯乙烯，可随意处理悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养贴壁培养 设备：Cell factory由圆柱形陶瓷基质套筒构成，内含许多1mm2正方形体腔，可用面积达0.4-12.5m2，放大面积可达210m2悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养贴壁培养 设备：Opticell贴壁-悬浮培养贴壁-悬浮培养，又称假悬浮培养，主要是为了结合悬浮培养和贴壁培养的优点而避免其不足。悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养悬浮培养：操作简便，细胞密度低贴壁培养：操作复杂，细胞密度高贴壁-悬浮培养贴壁-悬浮培养，又称假悬浮培养，主要是为了结合悬浮培养和贴壁培养的优点而避免其不足。微载体培养包埋（或微囊）培养结

18、团培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微载体培养1967年，荷兰的van Wezel首先采用葡聚糖Sephadex A50微小颗粒培养贴壁细胞获得成功1980S已被正式用于工业化生产各种疫苗和其他细胞产品，并出现了一大批商品化的微载体（microcarrier）。悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微载体培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微载体培养1980S后期，又开发出多孔微载体（或称多孔微球），极大地增加了供细胞附着的比表面积，且适用于悬浮培养。悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微载体培养加入钛等金属增加比重 适用于固定床反应器不加钛比重轻 可用于通气搅拌罐式生物反应器、气升式生物反应器。悬浮培养贴壁

19、培养贴壁-悬浮培养微载体培养理想的微载体：1、表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸展和增殖2、材料无毒性，对细胞、人体3、材料惰性，不与培养基成分发生化学变化，也不吸收营养成分4、材料软性，避免在搅拌中损伤细胞5、比重适中，在1.030-1.045g/ml，在低速搅拌下就可悬浮，而静止时又很快沉降，便于换液和收获悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微载体培养理想的微载体：6、粒径溶胀性均一， 在60-250m之间，差异不大于20m，有利于细胞均匀地分布在各微载体表面7、具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况8、可耐120高温，便于采用高压蒸汽灭菌9、经简单处理后

20、可反复使用多次10、原料充分，制作简便，廉价悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养包埋（或微囊）培养细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊中早期主要用于固定细菌和酵母等，广泛应用于工业生产和环境保护中，后来才被移植于动植物细胞的培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养包埋培养用于包埋细胞的材料人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、环氧树脂多糖：纤维素、琼脂、琼脂糖、海藻酸钙等蛋白质：胶原、明胶、纤维蛋白等目前最普遍实用的是琼脂糖和海藻酸钙凝胶控制温度或离子种类可来改变材料的物相悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养微囊培养微囊培养在包埋培养的基础上发展而来微囊的制备：在形成凝胶后，用另一种电荷相反的材料与

21、之作用，使在载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内的载体液化目前，使用最多、最成熟的材料搭配是海藻酸钠-聚赖氨酸。 悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养包埋（或微囊）培养优点：1、细胞可获得保护，避免了剪切力的损害2、可获得较高的细胞密度 107-108cells/ml3、控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内，有利于下游产物的纯化4、可采用多种生物反应器进行大规模培养悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养结团培养1980年，Tolbert首先利用有些正常需要贴附在基质表面的细胞有形成结团的特点，用搅拌式反应器和灌流培养的方式获得了高密度的细胞实质：用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养如何促进结

22、团：在培养基内加入有些直径较小的颗粒，促使细胞先附着其上后再相互附着优点：载体用量少，细胞不能在载体上伸展，细胞呈球形；操作简便，节省了用于微载体的成本悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养S3 动物细胞制药的前景提高产量降低成本改进质量转基因动物组织工程 07转基因动植物制药提高产量降低成本改进质量组织工程提高产量首要的是提高表达水平鼠骨髓瘤细胞生产IgG 5pg/cellmin10L反应器培养，细胞密度为107/ml， 理论上720g/d，实际却只有1g/d主要原因：不了解细胞在体外调控基因表达的机制提高产量降低成本改进质量组织工程提高产量杂交瘤细胞中加入IPSF-I/-II： 产量可增加20倍I

23、mmunoglobulin production stimulating factor如何提高表达水平，还存在着很大的潜力提高产量降低成本改进质量组织工程提高产量在同一种CHO细胞中，所表达尿激酶原的产量，在几种不同的表达载体之间存在着很大的差异。鼠白血病病毒启动子载体 表达量高达100g/106d提高产量降低成本改进质量组织工程降低成本1、提高细胞的表达水平2、改进培养基配方，尽可能利用廉价原料 如：用蛋白胨取代昂贵的生长因子3、改变细胞的代谢途径（“代谢工程”）Bird:宿主细胞内导入谷氨酰胺合成酶基因，培养基中就不需加谷氨酰胺Pak:超级CHO（已转入胰岛素样生长因子基因、铁传递蛋白基因

24、），可直接培养于无血清培养基中，而无需另加这些因子。提高产量降低成本改进质量组织工程改进质量主要是指糖基化质量问题糖基化的有无和正确与否直接关系到药效、药代动力学和免疫原性如：非糖基化EPO在体内没有生物活性 大肠杆菌生产的CSF会引起抗体的产生提高产量降低成本改进质量组织工程改进质量细胞种属不同，糖基化质量也不同昆虫表达系统产量最高 但是糖基化的种类与天然产品相差很大 因此，虽有300多种产品表达成功，但只有个别产品被批准应用于临床。提高产量降低成本改进质量组织工程改进质量如何改进质量？1、“糖基化工程”：人为地改变细胞的某些酶基因，改进和控制培养条件，达到产物正确糖基化的目的。如：在CHO

25、细胞中表达IFN-时共转染-2,6-唾液酸转移酶基因，可提高唾液酸化程度2、应用人类的细胞作为宿主细胞： 如：Namalwa细胞表达t-PA、EPO等所得产品的糖基化与天然产品完全一样。提高产量降低成本改进质量组织工程组织工程组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或者用培养的细胞进一步加工构成一种组织，并用于临床治疗。胰岛细胞糖尿病胎儿中脑细胞帕金森病成肌细胞杜兴肌营养不良症基因治疗：细胞治疗人造皮肤人造骨骼人造肝脏人造胰腺人造血管S4 植物细胞制药植物细胞工程是指定向改造植物细胞遗传性，利用植物细胞生产有用物质的技术。目前应用最广的有三方面内容：1、植物的无性快速繁殖及育种2、细胞大量培养及生产药用成分（次生代谢物生产）3、转基因植物S4 植物细胞制药“回归自然”，开发植物药物30