分子细胞遗传学一课件

1、分子细胞遗传学一分子细胞遗传学一分子细胞遗传学一原位杂交(In situ hybridization)1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) 70年代 2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) 80年代中后期 （1）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；2）低特异性；3）高背景；4）暴光时间长；5）结果统计学处理繁琐。Lichter P. Cremer T. Ward D.C.原位杂交(

2、In situ hybridization)1FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization).FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescen

3、t molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.FISH: (Fluorescent In Situ H

4、yb分子细胞遗传学一分子细胞遗传学一*荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。*FISH有上述优点的原因：1）使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) 半抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记） Cy2或FluorX(绿色) / Cy3(橙色) / Cy3.5(猩红色) / Cy5(红色) / Aqua(兰色) 间接标记的信号检测（抗biotin或digoxigenin抗体上连接荧光物质）物质： conjugated to avidin or antibody of di

5、goxigenin (1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或Bidopy绿色 (2)Texas Red, Rhodamine, 红色 (3)AMCA兰色染色体复染的物质: Propidium Iodide (PI)（红色），DAPI（兰色），quinacrine（绿色），chromomycine A3（绿色）*荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性 2）染色体“原位抑制”杂交（chromosome in situ suppression, CISS)克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性DNA(comp

6、etitor DNA)，如human Cot-1 DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。*FISH技术的应用1）基因（或DNA片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；4）肿瘤遗传学研究2）染色体“原位抑制”杂交（chromosome in si*用于FISH的探针1）单拷贝探针： （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合

7、体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。*用于FISH的探针1）单拷贝探针： （1左：DNA片段的染色体定位 右：嵌合体检出左：DNA片段的染色体定位 右：嵌合体检出FISH检测微小缺失FISH检测微小缺失染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1ABABDirect DupNormalNormal染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1ABABD左图：染色体断裂点分析 21号染色体长臂断裂点精确定位右图：21q22.2 BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号左图：染色体断裂点分析 21号BAC 1D

8、9 on 2p21 Detected Amplifications on Thyroid Tumor Cell Line WROBAC 1D9 on 2p21 Detected Ampli2）简单重复序列探针(simple repetitive probes)异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)其靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研

9、究和临床诊断 2）简单重复序列探针(simple repetitive p分子细胞遗传学一*间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗传物质的研究提供了可能，而且快速。*间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几3）染色体涂染探针(chromosome painting probes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：（1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组织融合的产物；（2）荧光激活的

10、流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆/PCR扩增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；染色体涂染方法：（1）正向(forward)：正常probe杂交到待检测的异常标本上；（2）逆向(reverse)：分离异常染色体制备探针，杂交到正常标本上。应用（1）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。*不能用于间期FISH3）染色体涂染探针(chromosome painting 分子细胞遗传学一FISH检测（chromosome pai

11、nting)染色体易位FISH检测（chromosome painting)染色体分子细胞遗传学一4）多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex FISH, M-FISH probes)#两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。 #采取结合或比率标记的方法进行标记探针。在一套特殊的滤光片和计算机软件系统辅助下，可制作24条染色体的彩色核型。应用：(a)染色体数目和结构异常及断裂点分析多色FISH或M-FISH (b)标记染色体识别多色FISH或M

12、-FISH (c)不同种属间基因组同源性比较多色FISH (d)多个DNA片段同时定位多色FISH*M-FISH不能检测染色体内的倒位、小片段缺失与重复。4）多色FISH（muti-color FISH) 多色FISHM-FISH技术多色FISH5）彩色显带FISH（Rx-FISH）探针根据灵长类动物与人类基因组的同源性制作探针，使人类的24条染色体显示出彩色带型。5）彩色显带FISH（Rx-FISH）探针根据灵长类动物与*比较基因组杂交(comparative in situ hybridization)探针位整个基因组DNA，而不是一个点或一个区域，主要用于确定未知区域的DNA扩增或缺失。

13、特别是回避了实体肿瘤染色体制备的难题，是其它FISH方法难以替代的。但操作难度较大。应用：(a)肿瘤遗传学研究发现新的癌基因和抑癌基因； (b)相关种属间和同一种属内不同个体之间基因组差异； (c)染色体不平衡片段识别和染色体重排研究。*比较基因组杂交(comparative in situ 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)比较基因组杂交(comparative genomic h*染色质 fiber FISH染色质从细胞中释放出来后，做FISH。信号由中期或间期的点状，形成线状排列。可提高定位的分辨率。应用：(a)估计cosmid和YAC或BAC克隆重叠群的重叠程度，以及 gap的有无和大小； (b)确定DNA微小缺失与重复； (c)染色质