复旦大学基因诊断与基金治疗教案05基因诊断的临床思路

1、第五章 基因诊断的临床思路1 基因诊断的起源基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。最早起源于对单基因遗传病的辅助诊断，而现代的基因诊断范围已大大扩展，不仅能对某些疾病做出确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。2 辅助诊断的疾病类型基因诊断能够对某些疾病做出确切诊断，对其它复杂疾

2、病，有些发病原因不明，有些由遗传因素和环境因素共同作用所致，导致分子诊断不能够作为主要诊断指标，而处于辅助诊断的地位。如多基因遗传病、染色体遗传病、线粒体病、传染性疾病、肿瘤、慢性疾病等表：分子遗传学可检测的疾病疾病名称 检测基因位点 检 测 目 的 遗传性脊髓小脑性共济失调（SCA） SCA1、2、3、6、7患者基因诊断、症状前诊断、产前诊断 齿状核-红核-苍白球-路易氏管萎缩症（DRPLA） DRPLA患者基因诊断、症状前诊断 弗雷德里希共济失调（FRDA） X25/ FRDA1患者基因诊断、症状前诊断、携带者筛查 亨廷顿舞蹈症（HD） HD（IT15） 患者基因诊断、症状前诊断 进行性肌

3、营养不良症（DMD/BMD） DMD患者基因诊断、产前诊断、携带者筛查 强直性营养不良症（DM） DMPK患者基因诊断 脊肌萎缩症（SMA） SMN1患者基因诊断、症状前诊断、产前诊断、携带者筛查 脊髓延髓性肌萎缩症（SBMA） AR患者基因诊断、症状前诊断、产前诊断、携带者筛查 眼咽型肌营养不良症（OPMD） PABPN1患者基因诊断、症状前诊断、产前诊断、携带者筛查 遗传性腓骨肌萎缩症（CMT） PMP22患者基因诊断、症状前诊断、产前诊断 Prader-Willi 综合征（PWS）、Angelman综合征 (AS) SNRPN1患者基因诊断 甲型血友病 （HA） Factor 患者基因诊

4、断、产前诊断、携带者筛查 乙型血友病 （HB） Factor 产前诊断 -地中海贫血 HAB患者基因诊断、产前诊断、携带者筛查 -地中海贫血 HBB患者基因诊断、产前诊断、携带者筛查 成人性多囊肾病（APKD） PKD产前诊断 男性原发不育Y染色体AZF微缺失诊断 AZF男性原发无精、寡精症遗传缺陷 性别决定基因SRY诊断 SRY性别发育异常、性连锁遗传病产前诊断等 4 疗效观察与药物筛选药物筛选如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药

5、前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再cDNA表达文库得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有，利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显

6、阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。5 产前诊断及症状前诊断产前诊断：基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。以血友病为例，对高危胎儿可在妊9-12周通过绒毛膜活检；妊12-16周进行羊水穿刺，近来还可在胚胎植入前通过早期胚胎（8个细胞时）获取胎儿DNA，通过DNA基因型和遗传表型确定胎儿性

7、别，以及进一步判断是否为血友病或携带者。妊18-20周可在胎儿镜下取脐静脉血，测定FVIII:C和FVIII:Ag。上述方法都存在流产的危险（约0.5%-1%）, 需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术（FACS）测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期，无创性产前诊断的方法。症状前诊断症状前基因诊断主要用于一些遗传病家系或有遗传病倾向的家系中目前未发病、但有高度发病风险人群的诊断，特别适用于一些早期诊断后可进行预防性干预措施，避免出现严重不良后果的病人。以脊髓小脑性共济失调为例，探讨脊髓小脑性共济失调的症状前患者分子遗传学诊断及其面临的有关问题。对临床诊断为

8、脊髓小脑性共济失调(SCA)患者进行基因诊断的同时，根据申请者要求检测其家系“健康”个体，采用聚合酶链反应（PCR）对三核苷酸重复（TNR）片段进行扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳并计算其长度,，推算正常和异常扩增等位基因内TNR重复拷贝数。通过基因检测诊断出症状前患者。6 易感状态的预测与用药指导基因诊断是属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法，该方法直接探查基因的存在状态及功能，即基因型的改变，可对疾病作出可靠的诊断，又称DNA诊断。基因诊断技术主要包括核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶酶谱分析、单链构象多态性分析以及DNA序列测定、差异显示等技术。上述技术与芯片技术相结合，

9、可用于易感基因的检测。遗传易感性疾病的基因诊断包括有：家族性高脂血症的基因诊断，糖尿病的基因诊断，高血压的基因诊断，动脉粥样硬化的基因诊断等。用药指导随着人类基因组计划（HGP）的完成，药物基因组学（pharmacogenomics）作为新兴学科在临床药学实践中发挥着越来越重要的作用。目前，利用基因诊断技术便可以分析出某一药物主要代谢酶的基因是否异常，从而客观、准确地了解这一个体在药物反应方面的特异性。日本学者给263例患者服用同一剂量的去甲替林，结果发现血浆中该药浓度的个体差异可高达100倍以上。药效的个体差异来源于遗传类型的不同。基因诊断在药物基因组学中的应用使得包括药物浓度监测（TDM）

10、、用药指导（包括个体医疗）以及新药3期临床的管理等工作发生巨大变化，日本学者对此进行了大胆尝试。随着基因诊断技术（特别是基因芯片）准确性的提高、成本的降低、结果判定的加速，相信在不远的将来会用于日常药物治疗中。研究表明，除了年龄、性别、体重、健康状况、肝功能等临床因素对药物疗效有影响外，遗传因素尤为重要。遗传背景的微小差别被称为多态性，它决定了同样的药物对不同的人会有不同的治疗效果。由于大多数药物疗效是通过基因产物（酶或蛋白）的相互作用所致，基因多态性直接影响到药物的代谢酶活性、药物转运蛋白以及药靶的基因变异，从而使药物的吸收、分布、排泄以及代谢发生变化，出现个体药物反应的差异。运用基因检测的

11、手段，结合个人以前的用药情况和效果，评估个体对某些药物的代谢能力、药物的转运率以及药靶的作用效果，给出个性化用药指导，以便合理选择药物的种类、剂量和剂型。包括这些药物：通用名英文名商品名、别名适应症基因硫唑嘌呤Azathioprine依木兰TPMT6-巯基嘌呤6-Mercaptopurine乐疾宁急性白血病TPMT埃罗替尼Erlotinib他西卫晚期非小细胞肺癌（NSCLC）BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS吉非替尼Gefitinib易瑞沙晚期非小细胞肺癌（NSCLC）BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS伊立替康Irinotecan开普拓晚期结直肠癌UGT1A15-氟尿嘧啶5-FuD

12、PD7 基因结构与基因功能的分析基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA或RNA，反映基因的结构和功能。自身基因结构异常导致基因功能异常而致病，或使其表达产物蛋白质的结构与功能异常而致病，或使基因调控异常而致病，如遗传性疾病、肿瘤等。基因变异致病的类型：1.内源基因的变异基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位基因表达异常mRNA剪接异常2.外源基因的插入8基因突变的诊断点突变的诊断诊断已知的点突变 （PCR/ASO）一对探针，突变碱基置探针

13、中央，控制杂交条件结果分析：反向杂交技术基因芯片技术：可检测出新的突变类型诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序DNA芯片技术针对不同的点突变可采用的方法：PCR和限制酶酶解PCR/ASOH等位基因特异的PCR变性梯度凝胶电泳PCR/SSCPPCR/双脱氧指纹法（DDF）PCR/测序9基因诊断与人群的关系群体中的多态现象是在一个群体中存在由遗传决定的两种或两种以上的变异型或基因型，其中频率最低的形式也远远高于依赖突变所能维持的频率。正是不同基因座等位基因的多种组合，导致群体的高度遗传多样性和个体的遗传独特性。 中国苗族人群血管紧张素原基因变异与心肌梗死的关系探讨中国苗族人群血管紧张素原（AGT

14、）基因M235T分子变异与心肌梗死（MI）的关系。方法 采用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性（PCR/RFLP）分析，对73例MI和116例健康对照组进行AGT基因M235T等位基因检测。结果 MI患者AGT组235TT型（78.08%）高于对照组（43.96%），差异有非常显著性（P0.001）；T235等位基因（86.30%）的频率亦显著高于对照组（64.50%），差异有显著性（P0.05）。结论 AGT基因235TT型可能是中国苗族人群MI发病的重要危险因素之一。中国汉族人群14号染色体上五个STR的遗传多态分析根据McKusick等6及NIH()的资料，目前已定位于14号染色体上的疾

15、病有15种，其中10种定位于14q31和14q32上，我们所选的这五个位点中的D14S617、D14S606和D14S611均位于这个区域；D14S306位于14q12(该区域为肥大性心肌病的定位区域)；D14S742位于14q11.2(该区 域为T细胞白血病/淋巴瘤的定位区域)。因此，研究这五个位点在中国汉族人群的多态性分布，对进一步研究这些位点与有关疾病的关系有重要意义。这五个多态位点，在白种人群中有较高的杂合度，在我们所观察的中国汉族人群中，D14S742和D14S306均检测到5个等位片段，D14S606和D14S611检测到6个等位片段，D14S617检测到9个等位片段，它们的杂合度

16、都高于0.65，说明这五个多态位点在中国汉族人群中也有较好的多态性，这对连锁分析、基因诊断和个体鉴别等都有很重要意义。江苏汉族人群F基因内微卫星DNA多态性研究及其在基因诊断中的应用为研究江苏地区汉族人群F基因内微卫星DNA CA-13、CA-22的多态性,并探讨其在血友病甲基因诊断中的应用价值,我们用聚合酶链反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法,分别检测了86名(131条X染色体)和74名(109条X染色体)江苏汉族人CA-13、CA-22的长度多态以及三个血友病甲家系成员这两个微卫星的长度变化.结果发现CA-13、CA-22分别有7种、4种等位片段,多态信息量(polymo

17、rphism information content,PIC)分别为0.5149、0.5202.用这两个微卫星进行家系连锁分析,两个家系得到诊断,并检出一名携带者.本研究表明微卫星标记CA-13、CA-22具有高多态性,联合应用这两个微卫星,理论上可使家系完整的血友病甲携带者检出率及产前诊断率达77%.利用微卫星标记进行连锁分析有望成为一种高效的血友病甲携带者检出及产前诊断的新方法.10 基因诊断与分子诊断分子诊断是临床检验诊断的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而对疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平的信息。基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态