华北理工药物分析课件04药物的含量测定方法与验证

1、第四章药物的含量测定方法与验证2022/9/82第四章药物的含量测定方法与验证 定量分析方法的分类与特点 1样品分析的前处理方法 2药品质量标准分析方法验证 32022/9/83第四章熟悉分析法的原理2. 不同前处理方法的适用范围3. 不同方法对验证内容的要求掌握容量,光谱和色谱分析法2. 滴定度与含量计算3. 系统适用性试验内容与要求4. 样品分析的前处理方法5. 分析方法的验证内容学习要求滴定液的配制与标定2. 分析仪器的校正和检定了解2022/9/84概述评价药物质量的重要指标 含量容量分析法光谱和色谱分析法 方法制剂:灵敏,专属 原料药:准确,重现剂型鉴别,检查和含量测定方法准确,稳定

2、,耐用方法学验证2022/9/85第一节定量分析方法的分类与特点 一、容量分析法二、光谱分析法 三、色谱分析法 2022/9/86一、容量分析法(一) 特点与适用范围 (1) 方法简便易行 (2) 方法耐用性高 (3) 测定结果准确 (4) 方法专属性差 适用于原料药含量测定(二) 有关计算:1. 滴定度与滴定度计算2. 含量计算 (1) 直接滴定法 (2) 间接滴定法 生成物滴定法 剩余量滴定法 也称滴定法: 将已知浓度滴定液滴加至 被测药物溶液中,至滴定终点,根据滴 定液的浓度,体积和滴定度,计算含量 容量分析法2022/9/87自动电位滴定仪2022/9/88(二) 相关计算每1ml规定

3、浓度的滴定液所相当的被测药物的质量, mg 1. 滴定度每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6 2022/9/8101. 滴定度 溴酸钾法测定异烟肼(C6H7N3O=137.14)的含量, 溴酸钾滴定液浓度为0.01667mol/L (KBrO3为单元) 反应式: 每1ml溴酸钾滴定液(0.01667mol/L) 相当于3.429mg的异烟肼(C6H7N3O) 滴定度:2022/9/8112. 含量测定 直接滴定法 生成物滴定法 剩余量滴定法 (1)(2)(3)2022/9/812(1) 直接滴定法注意掌握滴定反应的原理, 药物与滴定剂在反应中的摩尔比正确计算

4、滴定度和百分含量 直接滴定法计算容量分析法 取Vc约0.2g，精密称定（0.2011g），加新沸过的冷水100ml 与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液(0.05005mol/L)滴定，至溶液显蓝色并在30秒钟内不褪,消耗滴定液22.50ml，求含量（99.0%)。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg 的C6H8O6。Mw =176.132022/9/814(2) 生成物滴定法注意摩尔比的替换药物与A作用生成B, 用滴定液滴定B百分含量计算方法与直接滴定法相同 2022/9/815(2) 生成物滴定法滴定度 葡萄糖酸锑钠含量测定: 本品约0.3g,

5、加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml,暗处放置10分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg锑(Sb)反应式:2022/9/816(3) 剩余量滴定法(回滴法)加入定过量滴定液A, 用滴定液B滴定剩余的A注意: 滴定度为滴定液A的滴定度无空白进行空白校正2022/9/817(3) 剩余量滴定法 司可巴比妥钠含量测定: 本品约0.1g, 加水10ml溶解, 精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml, 再加盐酸5ml, 放置15分钟, 加碘化钾试液10ml, 用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定, 滴定的结

6、果用空白试验校正 W=0.1022g; 硫代硫酸钠滴定液 F=1.038; 供试品消耗硫代硫酸钠滴定液15.73ml;空白23.21ml I22Na2S2O32NaINa2S4O6KBrO35KBr6HCl3Br26KCl3H2O Br2(剩余)2KI2KBrI22022/9/819(3) 剩余量滴定法滴定度司可巴比妥钠M=260.27, 与溴摩尔比为1:1 2022/9/820(3) 剩余量滴定法 滴定液A与滴定液B浓度是相当的 溴滴定液(0.05mol/L)与硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当 因为溴(Br2)等摩尔转化为碘(I2), 而碘(I2)与硫代硫酸钠(Na2S2O3)反应的

7、摩尔比为1:2, 所以溴滴定液与硫代硫酸钠滴定液的浓度比也是1:2 滴定液A与滴定液B经浓度校正后的消耗体积(V=VF)是相当的2022/9/821二、光谱分析法定义分类 UV-Vis 利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法光谱分析法 IR AA FluorFP(flame photometry)2022/9/822(一) 特点与适用范围F-IR2022/9/823(一) 紫外-可见分光光度法1. 特点与适用范围 (1) 方法简便易行 (2) 方法灵敏度高 (3) 结果准确度较高 (4) 方法专属性较差 制剂含量测定与定量检查2. 仪器校正和检定 (1) 波长 (2) 吸光度的准确度 (

8、3) 杂散光 3. 测定法 对照品比较, 吸收系数 计算光谱, 比色法基于对紫外光区(200400nm)和可见光区(400760nm)单色光吸收特性的分析方法 原理: UV-Vis2022/9/824(1) 对照品比较法原料药 制剂 氟康唑片溶出度检查: 取本品(规格:100mg), 盐酸溶液(91000)1000ml为溶出介质, 经45分钟时, 取溶液滤过; 取续滤液, 在261nmm波长处测定吸光度; 另取氟康唑对照品适量, 精密称定, 加溶出介质溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg 的溶液, 同法测定, 计算每片的溶出量溶液浓度 2022/9/825(2) 吸收系数法原料药 制剂溶

9、液浓度 盐酸氯丙嗪注射液(规格：xx ml : xx mg)的含量测定：精密量取适量(V ml, 相当于盐酸氯丙嗪50mg), 置200ml量瓶中, 用盐酸溶液(91000)稀释至刻度, 摇匀; 精密量取2ml, 置100ml 量瓶中, 用盐酸溶液稀释至刻度, 摇匀, 在254nm 的波长处测定吸光度, 按吸收系数( )为915计算 (3) 标准曲线法1.作标准曲线，测出Ax，求Cx2.求回归方程，y=aX+b，代入Ax，计算Cx2022/9/827(二) 荧光分析法1. 特点 (1) 高灵敏度 (2) 荧光自熄灭 (3) 易受干扰 (4) 线性范围窄 (RXRXb)/(RrRrb)=0.52

10、 2. 消除干扰 (1) 溶剂:空白对照 (2) 溶液:稀,净,充氮,pH (3) 器皿:洁净,无机清洁液3. 测定法: 对照品比较物质受UV或Vis照射激发后能发射出比激发光波长长的荧光; 激发光停止照射, 荧光随之消失; 激发和发射光谱用于定性, 荧光强度用于定量 Fluor2022/9/828三、色谱分析法特点与应用分类 依据分离原理：(1) 高灵敏度:ng-g/ml(2) 高专属性:选择性检测(3) 高效能与高速度 吸附;分配;离子交换;分子排阻色谱法 复方制剂含量测定的首选方法 依据分离方式：纸色谱;薄层色谱;柱色谱;气相色谱;高效液相色谱法 2022/9/829F-IR2022/9

11、/830(一) 高效液相色谱法1. 仪器(RP-HPLC) (1) 色谱柱: ODS最常用; 粒径一般在3-10m; 温度40 (2) 检测器: UV(DAD,PDA); Fluor, ELSD, RID, ECD, MS (3) 流动相: 首选甲醇-水(末端波长检测:乙腈-水), 有机相5%; pH2-8 2. 系统适用性试验 (1) 色谱柱的理论板数(n) (2) 色谱峰的分离度(R) (3) 色谱系统的重复性(RSD%) (4) 色谱峰的拖尾因子(T)3. 测定法 (1) 内标法 (2) 外标法不得改变：固定相种类,流动相组分,检测器类型可以改变：色谱柱内径, 长度, 载体粒度 流动相流

12、速, 混合流动相各组分的比例 柱温; 进样量; 检测器的灵敏度HPLC2022/9/8312. 系统适用性试验分离度(R): 用于评价组分的分离程度; 关键指标重复性: 用于评价连续进样系统响应的重复性能 拖尾因子(T): 用于评价色谱峰的对称性理论板数(n): 用于评价色谱柱的分离效能n=(tR/)2=16(tR/W)2; n=5.54(tR/Wh/2)2;RSD 2.0R 1.5T=0.95-1.052022/9/8323. 测定法与计算(2) 外标法氨酚待因片(I)的含量测定取本品20片, 精密称定, 研细, 精密称取适量, 置250ml量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 滤过, 取续滤液

13、10l进样; 另精密称取磷酸可待因与对乙酰氨基酚对照品适量, 加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含磷酸可待因0.03mg和对乙酰氨基酚2mg的溶液, 同法测定(1) 内标法(二) 气相色谱法2022/9/833GC色谱柱：常用毛细管柱熔融石英或玻璃 内径一般为0.25mm,0.32mm或0.53mm; 柱长560m，内壁或载体经交联或涂渍固定液; 固定液膜厚0.15.0m 固定液: 甲基聚硅氧烷, 苯基甲基聚硅氧烷, 聚乙二醇 2022/9/834(二) 气相色谱法检测器FID进样方式 (1) 溶液直接进样: 不超过数微升(l); 毛细管柱分流 (2) 顶空进样: 供试液于密闭小瓶中, 加热至

14、待测组分达到液-气平衡, 进样器自动吸取一定体积的顶空气进样 2. 系统适用性试验 同HPLC3. 测定法 (1),(2) 同HPLC (3) 标准溶液加入法 对照品溶液适量, 精密加入到供试品溶液中, 测定含量, 扣除加入的对照品溶液含量即得 1.头孢唑啉钠的含量测定色谱条件与适用性试验: 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸氢二钠枸橼酸溶液（取无水磷酸氢二钠1.33g与枸橼酸1.12g，加水溶解并稀释成1000ml)-乙腈（88:12）为流动相；监测波长254nm。供试品溶液: 取本品适量，精密称定为0.0252g，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。精密量取该溶液1.0ml置1

15、0ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。对照品溶液: 取头孢唑啉对照品适量，精密称定为10.62mg,置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度.测定法:取上述两种溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱峰面积A供=1570439,A对=1674389,按外标法以峰面积计算出供试品中头孢唑啉的含量。2.取异戊巴比妥钠0.2052克，精密称定，依法用硝酸银滴定液（0.1010 mol/L）滴定，用去该滴定液8.10ml，已知每1ml的硝酸银滴定液（0.1mol/L）相当于24.38mg的C11H18N2NaO3，试计算异戊巴比妥钠的百分含量。3.取维生素B120片，精密称定，20片片重为1.57

16、86g，研细，精密称取细粉（约相当于维生素B125mg）0.4031g，置100mL量瓶中，加盐酸溶液（91000）约70mL，振摇15分钟使溶解，加盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸过滤，精密量取续滤液5mL，至另一100mL量瓶中。再加盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀，在246nm波长处测定吸收度，为0.526，吸收系数E11cm 421，计算维生素B1片含量相当于标示量的百分含量。维生素B1片的标示量为5mg。2022/9/838第二节样品分析的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法 二、经有机破坏的前处理方法(一) 水解法; (二) 还原法(一) 干法破坏; (二

17、) 湿法破坏2022/9/839一、不经有机破坏的方法 1.酸水解法水难溶性含金属有机药物与矿酸(盐酸)共热: 十一烯酸锌测定 回流有机结合的待测元素原子离解, 转化为无机盐(离子)2. 碱水解法含卤素有机药物(脂肪碳链)与氢氧化钠溶液回流: 三氯叔丁醇测定 适用于: 结合不牢固的 含金属或含卤素有机药物(一)水解法2022/9/840一、不经有机破坏的方法碘他拉酸测定:氢氧化钠试液与锌粉回流后, 用硝酸银滴定 回流碱性溶液中加锌粉回流, 使碳-碘键还原转化为无机碘化物碘番酸胆影酸胆影葡胺注射液泛影酸泛影酸钠泛影葡胺注射液 适用于: 结合牢固的含碘有机药物 (直接与芳环连接) (二)还原法20

18、22/9/841二、经有机破坏的方法(一) 湿法破坏 适用于含氮有机药物分析的前处理 硫酸作为分解剂, 氧化剂(硝酸,高氯酸)辅助分解剂 凯氏定氮法 (二) 干法破坏高温炽灼法 含卤素药物的鉴别、含磷药物含量测定 无水碳酸钠,硝酸镁,氢氧化钙, 氧化锌等辅助灰化 2. 氧瓶燃烧法适用于: 含金属, 卤素, 氮, 硫, 磷等 有机药物 (待测原子与碳原子结合牢固者)1、湿法破坏硝酸-高氯酸法硝酸-硫酸法硫酸-硫酸盐法其它湿法注意：1.空白校正 2.通风橱内1. 湿法破坏 （1） 硝酸-高氯酸法 本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。 本法不

19、能用于含氮杂环药物的破坏 （2） 硝酸-硫酸法 本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。 本法不能用于含碱土金属有机药物的破坏 （3） 硫酸-硫酸盐法 本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。 本法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。 （4） 其它湿法 硝酸硫酸高氯酸法 硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾法） 破坏后，金属呈高价态2. 干法破坏 适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。 不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏2022/9

20、/8481. 凯氏定氮法 (2) 消解剂与助剂: 硫酸-硫酸钾-硫酸铜 (3) 操作法供试品: 常量法含氮2530mg; 半微量法: 1.02.0mg消解: 溶液成澄明的绿色, 继续加热30min蒸馏与接收: 40%氢氧化钠碱化, 水蒸气蒸馏, 2%硼酸溶液吸收 滴定: 甲基红-溴甲酚绿指示液, 硫酸滴定液(0.05mol/L), 灰紫色 (1) 仪器装置 (4) 应用范围: 含有氨基或酰氨(胺)结构 2022/9/8491.凯氏定氮法2022/9/8501. 凯氏定氮法 扑米酮的含量测定取本品约0.2g, 精密称定, 照氮测定法测定; 每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于10.91

21、mg的扑米酮(C12H14N2O2) 关键步骤: 消解试剂作用: 硫酸-消解剂; 硫酸钾-提高沸点; 硫酸铜-催化剂; 硼酸-固氮(NH3H3BO3)(5) 示例与讨论C12H14N2O2 = 218.262022/9/8512. 氧瓶燃烧法 仪器装置铂丝: 1mm; 2/3瓶: 硬质玻璃(石英玻璃)10-20mg500ml200mg1000-2000ml含待测元素的有机药物在充满氧气的燃烧瓶中充分燃烧有机结构: 彻底分解为CO2和H2O待测元素: 转化为不同价态的氧化物(或无氧酸)被吸收于适当的吸收液中(多以酸根离子形式存在) 氧瓶燃烧法经有机破坏的分析方法将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧

22、瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据预测物质的性质，采用适宜的方法进行分析。适合于含X、S、N、Se等元素的有机药物。特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于 微量样品的分析 （ 2） 仪器与材料 仪器装置 燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状称样用材料及称样 A. 固体样品 无灰滤纸 B. 液体样品 纸袋 C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹2022/9/855吸收液 A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫

23、、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态氧气2022/9/8572. 氧瓶燃烧法 (2)燃烧产物与吸收液氟HF:水氯HCl:水-氢氧化钠溴Br2+HBr:水-氢氧化钠-二氧化硫碘I2(+HIO): 水-氢氧化钠(二氧化硫)硫SO3(+SO2):水-过氧化氢磷P2O5H4P2O7,(HPO3)n:水-硝酸(煮沸)根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。注意事项 ChP（2010）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析正确选用燃烧瓶的目的： 样品能在足够的氧气中燃烧分解完全； 有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中； 防止爆炸的可能性。测定含氟有

24、机药物时，用石英制燃烧瓶铂丝燃烧时起催化作用应同时做空白试验燃烧时要注意防爆燃烧要完全燃烧产生的烟雾完全被吸收2022/9/8612. 氧瓶燃烧法 (3) 碘苯酯的含量测定 20mg,氢氧化钠试液2ml与水10ml为吸收液吸收液,加溴-醋酸10ml,加甲酸1ml,并通空气3min加碘化钾2g,用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定摩尔比为1:6, T=416.34(1/6)0.02=1.388(mg) C19H29IO2 = 416.34 1. 氧瓶燃烧法可用于A. 含卤素有机药物的含量测定B. 醚类药物的含量测定C. 检查甾体激素类药物中的氟D. 检查甾体激素类药物中的硒E. 芳酸类药

25、物的含量测定2. 选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A. 磨口硬质玻璃锥形瓶B. 铂丝C. 普通滤纸D. 氢气 E. 无灰滤纸3氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A. H2O2溶液B. H2O2NaOH溶液C. NaOH溶液D硫酸肼饱和液E. NaOH硫酸肼饱和液2022/9/865需验证的项目验证的内容准确度 定量限防腐剂溶出度,释放度鉴别试验杂质检查含量测定第三节药品质量标准分析方法验证 精密度 专属性 检测限 线性 范围 耐用性重复性中间精密度重现性 2022/9/866一、准确度 accuracy(一) 含量测定方法 (二) 杂质定量测定 加入已知量杂质进行测试 (三) 数据要

26、求 9个测定结果3个不同浓度(80,100,120)每个浓度各3份 准确度系指用该方法测定的结果与 真实值或参考值接近的程度 一般用回收率(%)表示 定义验证内容-准确度质量标准分析方法验证准确度：是指用该方法测定结果与真实值或参考值接近的程度，用回收率（%）表示回收率%=（测定平均值 空白值）/加入量100% 要求制备高、中、低三浓度的样品各测定3次报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。 验证内容-准确度质量标准分析方法验证1. 化学药1)原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定 的结果进行比较。2)制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用

27、在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 验证内容-准确度质量标准分析方法验证 2. 中药 加样回收试验回收率% =（C-A)/BA为供试品所含被测组分的量；(已准确测定药物含量A的真实样品)B为加入对照品的量；C为实测值验证内容-准确度质量标准分析方法验证 2. 中药 取同一浓度供试品，6个测定结果进行评价或同化药应报告供试品取样量,供试品中含有量,对照品加入量,测定结果,回收率（%）和RSD%验证内容-准确度质量标准分析方法验证一般要求： RSD2% UV和HPLC： 回收率可达98%102%；容量法：回收率可达99.7%100.3% 2022/9/872二、精密度

28、precision1.重复性 同一分析人员连续测定所得结果的精密度; 也称批内精密度或日内精密度 2.中间精密度 不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度 批/日间精密度 3.重现性 在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度 法定标准采用的分析方法进行 同一均匀供试品多次取样测定所得 结果之间的接近程度 标准偏差(s,SD);相对标准偏差(RSD)数据要求同“准确度”定义2022/9/873三、专属性 specificity(一) 鉴别反应 空白, 结构相似物或有关物质呈负反应(三) 含量与杂质测定 含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离 在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能 存

29、在下,方法能正确测定出被测物的特性 鉴别,杂质检查和含量测定方法 定义与应用2022/9/874四、检测限 适用于可用目视法直接评价结果的 分析方法, 非仪器分析法 鉴别的显色法;杂质检查的TLC适用于能直观显示信号与基线噪声 水平的分析方法, 如HPLC法 信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量 适用于不能直观比较信噪比的仪器 分析方法, 如UV-Vis法 检测限(limit of detection, LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量LOD是一种限度检验效能指标,反映方法灵敏度 1.目视法 2.信噪比法 3.标准偏差法 2022/9/875五、定量限杂质和降解产物用定量方法

30、研究时, 应确定LOQ LOQ的测定方法与LOD相同相应的系数(倍数)不同, 如信噪比S/N=10定量限(limit of quantitation, LOQ )是指试样中被测物能被定量测定的最低量;反映方法的灵敏度测定结果应具有一定准确度和精密度 2022/9/876六、线性 linearity 与范围 range范围系指方法适用的高低限浓度或量的区间在试验研究开始前确定验证的范围和方法在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性线性系指在设计的“范围”内, 响应值(y)与被测物浓度(x)直接呈正比关系的程度 y = ax + b系列(n5)供试样品测定,以响应信号作为被测物浓度的函数作图用最小

31、二乘法进行线性回归; 或经数学转换后再进行线性回归2022/9/877六、线性与范围原料药/制剂含量测定: 80%120% 制剂含量均匀度检查: 70%130% 溶出度或释放度检查: 下限-20%上限+20%特殊元素含量测定: 下限-20%上限+20%杂质测定: 限度20%若杂质检查与含量测定同时进行, 杂质限度-20含量上限+20% 涉及定量测定的项目均需对范围进行验证如: 含量测定, 含量均匀度, 溶出度或释放度, 特殊元素或特殊杂质的定量检查2022/9/878七、耐用性 ruggedness耐用性系指在测定条件有小的变动时, 测定结果不受影响的承受程度; 体现测定条件的允许变动范围HPLC法典型因素有: 流动相的组成和pH值及流速, 不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱, 柱温等 GC法典型因素有: 不同厂牌或批号的色谱柱, 固定相, 不同类型的担体, 柱温, 进样口和检测器温度等 2022/9/879八、验证内容的选择 验证内容选择的一般原则:非定量分析方法 如鉴别,杂质的限度检查法: 验证“专属