散发性结直肠癌、腺瘤组织中hMLH1和突变型p53表达

1、散发性结直肠癌、腺瘤组织中hMLH1和突变型p53表达 董崇海曲玲赵清喜李杰郭春霞刁春艳王德仙【摘要】目的讨论hLH1和p53基因在散发性结直肠癌发活力制中所起的作用。方法采用PV-6000二步法免疫组化检测技术对60例散发性结直肠癌，45例大肠腺瘤和26例正常大肠黏膜石蜡切片进展hLH1和p53表达的检测。结果160例散发性结直肠癌hLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达分别为11例18.3%和32例53.3%，hLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度亲密相关P0.05或P0.01，而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大孝浸润深度、淋巴结及远处转移与否和

2、患者的Dukes分期均无显著相关性P0.05。2大肠腺瘤患者p53蛋白阳性表达与患者腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度亲密相关P0.05，而与患者性别、年龄无显著相关性P0.05。(3)散发性结直肠癌中hLH1蛋白阴性表达组p53蛋白阳性表达率18.2%，2/11低于阳性表达组61.2%，30/49P0.05。结论1大部分散发性结直肠癌是沿染色体不稳定途径发生，其中抑癌基因p53的突变起重要作用。同时，一定比例的散发性结直肠癌中存在错配修复基因的缺陷，并具有相对特殊的临床病理特征。2大肠腺瘤组织中有一定比例的hLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达，提示hLH1和p53基因的突变可能是散发性

3、结直肠癌发生的早期事件之一。【关键词】结直肠肿瘤错配修复基因hLH1基因p53基因免疫组织化学ExpressinfhLH1andp53inSpradilretalarinaandlretalAdenaAbstrat:PurpseTexplretherlefhLH1andp53geneinthearingenesisfspradilretalarina.ethdsTheexpressinfhLH1andp53prtEinin60asesithspradilretalarina,45asesithlretaladenaand26asesithnralintestinalusaeredetetedb

4、yPV-6000iunhistheialethd.Results(1)NegativeexpressinfhLH1prteinandpsitiveexpressinfp53prteineredetetedin11ases(18.3%)and32ases(53.3%)ithspradilretalarinarespetively.NegativeexpressinfhLH1prteinandpsitiveexpressinfp53prteinerelselyrelatedtpatientsage,turlatin,histlgialtypeandhistlgialgrade(P0.05rP0.0

5、1,buterentrrelatedithpatientsgender,turgrsstype,tursize,invasivedepth,lyphndeetastasis,distantetastasisandDukesstage(P0.05).(2)Thepsitiveexpressinfp53prteinaslselyrelatedtadenasite,histlgialtypeanddysplasiagrade,butitasntrrelatedithpatientsgenderandage(P0.05).(3)Thepsitiveexpressinfp53prteininthegru

6、pfhLH1prteinnegativeexpressin18.2%，2/11aslerthanthatinthegrupfhLH1prteinpsitiveexpressin61.2%，30/49inspradilretalarina(P0.05.nlusins(1)ajrityfspradilretalarinaursviathehrsalinstabilitypathayinhihthep53geneplaysaniprtantrle,eanhilethereisasubsetfspradilretalarinadisplayingisathrepair(R)defetithspeial

7、lylinialandpathlgialfeatures.(2)ThereisasubsetflretaladenadisplayingnegativeexpressinfhLH1prteinandpsitiveexpressinfp53prtein.utatinfhLH1geneandp53geneaybeanearlyeventfaringenesisinspradilretalarina.Keyrds:lretalneplass;isathrepairgene;hLH1gene;p53gene;iunhistheistry结直肠癌(lretalarina，R)是我国常见的恶性肿瘤之一，随

8、着医学生物技术以及分子生物学的飞速开展，人们已认识到本病的发生开展是一个多基因、多阶段、多步骤渐进演化的过程。结直肠癌的发生开展并不遵循单一的途径1。本研究旨在将染色体不稳定途径涉及的抑癌基因p53和错配修复途径涉及的错配修复基因hLH1结合起来，用免疫组化方法检测其在散发性结直肠癌和腺瘤组织的蛋白表达状况，分析其与临床病理学参数之间的关系，进而讨论p53基因与hLH1基因在散发性结直肠癌发病机制中所起的作用。1材料与方法1.1病例选择搜集青岛大学医学院附属医院2022年1月2022年5月临床资料完好的散发性结直肠癌常规石蜡包埋组织标本60例，其中男性38例，女性22例；年龄30岁88岁，平均

9、年龄55.6511.36岁。电子结肠镜下高频电凝切除的大肠腺瘤常规石蜡包埋组织标本45例，其中男性27例，女性18例，年龄27岁89岁，平均年龄53.8910.66岁。正常大肠黏膜组织26例作对照。所有标本切片均经两位资深病理医师确诊。不包括家族性腺瘤性息肉病failialadenatusplypsis，FAP患者和遗传性非息肉病性大肠癌(hereditarynnplypsislretalaner，HNP)患者。所有病例手术前均无系统的放疗和化疗病史。1.2免疫组织化学检测方法兔抗人hLH1多克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体分别购自美国Santaruz公司和美国Zyed公司，工作浓度分别为15

10、0和1100。PV-6000二步法免疫组化检测试剂购自美国Zyed公司。取存档蜡块3厚连续切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后置于新颖配制的3%H22去离子水室温孵育10in，然后蒸馏水冲洗。将切片放入盛有1EDTApH8.0，150抗原修复液的容器中，置微波炉内进展微波修复：火力1003in，火力307in3，进展抗原修复。室温下冷却，PBS磷酸盐缓冲液洗涤。滴加一抗，室温下孵育3h。PBS洗涤，滴加PV-6000二抗，置于37电热恒温水箱孵育20in，PBS洗涤，切片在0.04%DAB(二氨基联苯胺盐酸盐+1%H22中显色，见棕黄色颗粒后终止反响。苏木精复染，盐酸酒精分化，氨水反蓝。常规脱水，

11、二甲苯透明，中性树脂封片。用PBS取代一抗作阴性对照。1.3判断标准所有切片均由两位病理科资深专家阅片。每张切片选择有代表性区域，并避开切片的周边区域，光镜下随机观察10个高倍镜视野，记录10100个阳性细胞的百分比。阳性结果参照Friedrihs等2的免疫组化评判标准，分别观察染色强度和阳性细胞所占的百分数，先按染色强度计分染色深浅需与背景着色相比照，0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞所占百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞10%，2分为阳性细胞占11%50%，3分为阳性细胞占51%80%，4分为阳性细胞80%。将染色强度与阳性细胞百分比计分的积分相乘，乘

12、积2分为hLH1和p53蛋白阳性表达，乘积01分为hLH1和p53蛋白阴性表达。hLH1阳性染色定位在黏膜上皮细胞胞浆或核染色，正常肠黏膜和淋巴细胞为内对照阳性。p53蛋白阳性染色定位在细胞核为准。1.4统计学处理统计学方法应用SPSS11.5统计软件，行或Fishers准确概率法检验。2结果2.1hLH1和p53蛋白表达特征正常大肠黏膜、腺瘤及癌组织中hLH1阴性表达率分别为00/26、4.4%2/45和18.3%11/60，散发性结直肠癌组与正常组、大肠腺瘤组比较均差异有显著性P0.05，而大肠腺瘤组与正常组间差异无显著性P0.05。正常大肠黏膜、腺瘤和癌组织中p53蛋白阳性表达率分别为0

13、0/26、20.0%9/45和53.3%32/60，腺瘤和癌组织中p53蛋白阳性表达率与正常大肠黏膜比较均有显著性差异0.05，癌组织与腺瘤组织比较也有显著性差异0.01。2.2hLH1和p53蛋白表达与散发性结直肠癌临床病理学特征关系hLH1阴性表达和p53蛋白阳性表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度亲密相关P0.05或P0.01，而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大孝浸润深度、淋巴结及远处转移与否和患者的Dukes分期均无显著性相关P0.05。见表1。2.3hLH1和p53蛋白表达与腺瘤患者临床病理学特征关系大肠腺瘤患者p53蛋白阳性表达与患者腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度亲

14、密相关P0.05，而与患者性别、年龄无显著性相关P0.05。hLH1阴性表达与患者临床病理学参数间均无显著性相关P值均0.05。见表2。2.4hLH1与p53蛋白表达的关系p53蛋白阳性表达的散发性结直肠癌在49例hLH1蛋白阳性表达组有30例，占61.2%30/49，而在11例hLH1蛋白阴性表达组有2例，占18.22/11，两组之间差异有显著性0.05。p53蛋白阳性表达的大肠腺瘤病例在43例hLH1蛋白阳性表达组有9例，占20.99/43，而在2例hLH1蛋白阴性表达组那么为0例，两组之间差异无显著性0.05。3讨论目前认为R的发生主要可以分为两种发病途径：染色体不稳定hrsalinst

15、ability，I途径和错配修复isathrepair，R途径。I途径是结直肠癌发生的经典途径，涉及癌基因和抑癌基因的改变。其中以抑癌基因的失活作用更为重要，常伴有p53基因的突变。R基因保证了DNA复制的高度保真，一旦R基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活，导致机体错配修复功能的降低，进而导致整个基因组的不稳定，从而使某些癌基因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集，肿瘤由此发生3。R功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定highlevelirsatelliteinstability，SI-H，又称之为复制错误repliatinerrr，RER阳性，在此途径中，hLH1和hSH2这两个R

16、基因起主要作用47。近年研究发现，hLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示R功能缺陷的存在8。本研究结果显示，在60例散发性R病例中，有11例hLH1阴性表达，占18.3%11/60，发如今一定比例的散发性R中存在着R基因功能缺陷，此结果与hiaraualli等9的研究结果根本一致。本研究结果还显示hLH1阴性表达与患者的年龄40岁、肿瘤的部位近端结肠、组织学类型黏液腺癌和分化程度低分化关系亲密P0.05。另外，研究结果显示在一定比例的大肠腺瘤组织中也有hLH1阴性表达(4.4%)，但统计学分析hLH1阴性表达与患者年龄、性别、腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度间均无显著性差异P0.05，考

17、虑与所研究病例例数过少有关。提示在腺瘤阶段已经有R基因的突变或功能异常，hLH1基因的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。目前认为RER阳性散发性R主要是由于hLH1基因启动子甲基化导致hLH1基因的转录和翻译的静默而出现蛋白的表达缺失与SI引起10，11。p53基因与结直肠癌关系备受关注。p53基因分为野生型t-p53和突变型t-p53，野生型p53基因是极为重要的肿瘤抑制基因12。正常细胞中，t-p53基因蛋白含量很少，并且半衰期仅为20in左右，难以通过常规免疫组化方法检测到；而t-p53基因蛋白由于其构象改变且能与一些癌蛋白结合形成复合物，其稳定性增加，半衰期延长，可达2h12h，细

18、胞内聚集量比正常细胞高出1001000倍左右。因此，可用免疫组化方法检测出来。一些研究已经证实p53基因突变与p53蛋白的过度表达呈良好的相关性13。本研究结果显示，60例散发性R病例中，有32例p53蛋白表达阳性，占53.3%32/60，且p53蛋白阳性表达与患者年龄40岁、肿瘤部位远端结肠/直肠、组织学类型腺癌和分化程度中低分化腺癌关系亲密P0.05。研究结果还显示，腺瘤组织中有相当比例的p53蛋白阳性表达9/45，20%，统计学处理说明腺瘤组织中p53蛋白阳性表达与腺瘤部位远端结肠/直肠、组织学类型绒毛状腺瘤和不典型增生程度重度亲密相关。随着不典型增生程度的加重而p53蛋白阳性率逐渐升高

19、，提示p53基因突变主要发生在腺瘤癌序列的晚期，是结直肠癌发生的早期事件。p53蛋白阳性表达率在远端结肠腺瘤组织比在近端结肠高，推测可能与左右结肠来自不同的胚层，受基因调控作用不同有关。我们认为检测p53蛋白表达状况有利于预测腺瘤癌变倾向。运用免疫组化技术检测hLH1和突变型p53基因的蛋白表达，方法简便、快速有效，可应用于临床理论的指导，对临床识别不同发病机制导致的散发性R具有重要价值。随着研究的深化，对治疗方案的制定和患者的远期预后情况的预测可能有重要的临床应用价值。【参考文献】1SulieP,FureE,HaelinR,etal.TP53statusandgeneaplifiatinin

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