大鼠50%减体积肝移植技术的改进

1、PAGE PAGE 7 大鼠50%减体积肝移植技术的改进何勇1,2 姜骊1,2 鱼达1,2 谢海洋1,2 郑树森1,2（1， 浙江大学医学院附属第一医院 卫生部多器官联合移植研究重点实验室2， 浙江省器官移植重点研究实验室 ， 杭州 310003 ）【摘要】目的 建立改良的大鼠50%减体积原位肝移植的模型。方法 在经典的双袖套法大鼠肝移植模型的基础上，通过4次贯通穿刺、3次结扎、2次回折的肝脏缝扎方法，改善肝脏减体积切取的效果。结果 所有50%减体积原位肝移植的大鼠均存活良好，肝功能迅速恢复正常，达到实验设计对动物模型的要求。结论 采用本实验室规范的4贯通、3结扎、2回折的肝脏缝扎方法，可以建

2、立稳定的50%大鼠同种异体减体积原位肝脏移植模型，值得推广应用。【关键词】大鼠；减体积肝移植；动物模型The process optimization 0f 50% reduced-size liver transplantation in ratsYong He1,2, Li Jiang1,2, Da Yu1,2, Haiyang Xie1,2, Shusen Zheng1,21, Key Laboratory of Multi-Organ Transplantation, Ministry of Health；First Affiliated Hospital, Zhejiang Univ

3、ersity School of Medicine, Hangzhou 310003, China.2, Key Laboratory of Organ Transplantation in Zhejiang province, Hangzhou 310003, China.【Abstract】 Objective To investigate the methodological improvement and process optimization of 50% reduced-size liver orthotopic transplantation model in rats.Met

4、hods Base on the classical double-bushing model, establish new process to improve the effect of liver resection, with the method of penetrated puncture 4 rounds, ligate 3 times and 2 folds back to graft the 50% reduced-size donor liver orthotopically. Results All rats remain good conditions after op

5、eration, liver function keep back to normal level quickly. Conclusions With the surgical novel graft method, a stable 50% reduced-size orthotopic liver transplantation model could be established，it meet the requirement of design of experiment of animal model，and is worth promoting.【Key words】 Rat; R

6、educed-size liver transplantation; Animal model 基金项目“浙江省重点科技创新团队”项目（NO.2009R50038）作者简介何勇（1984 ），男，主要研究方向：小动物器官移植。E-mail: 通讯作者鱼达（1946 ），男，主要研究方向：器官移植，实验动物。E-mail: dayu46在对大鼠肝脏再生的研究1中，减体积的处理技术规范是十分重要的。 在研究的过程中，实验动物技术，是研究课题重要的直接参与和组成部分。大鼠全肝移植，在一些肝脏移植著作2,3和实验动物的论文4,5 中已有论述。在50%大鼠肝脏移植的操作技术上，不同的课题研究人员，可以采

7、用不同的方法。不同方法的技术优缺点不易评价，本文推荐我们的方法，认为值得应用推广。 1 材料和方法1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠80 只，81O周龄，体重200220g，由浙江省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(浙)2008-0033。本研究进行了40对大鼠的同种异体原位50减体积肝移植手术。其中， 40只用于提供50体积的供肝，40只为受体大鼠。每对供、受体大鼠体重相差15g，一般取供体大鼠的体重略小于受体。总体研究中1、3、5、7天分为4个实验组，每组（group）分为2小组（part1，part2），动物分2批购置，每小组有50%减体积肝移植大鼠5只，由同一操作者，分2个阶

8、段完成，见表1 。1.2 术前准备和麻醉动物饲养于清洁级动物实验室，新到的大鼠在动物实验室饲养3天以上。供体术前不禁食水，受体术前禁食12h，不禁水。麻醉： 供、受体均采用4%的水合氯醛0.6-0.7 ml/100g 腹腔注射麻醉。在麻醉前15 min，每只大鼠肌肉注射阿托品0.04 mg。1.3 供体手术供体大鼠麻醉、脱毛、常规消毒，取正中切口。游离、切断肝周围韧带，缝扎左膈下静脉；剪开尾状叶前方腹膜，游离尾状叶。距左、右肝管汇合处以下5 mm处切开胆总管前壁，插入胆管支架约2 mm结扎固定后切断胆总管远端。游离肝下下腔静脉和右肾静脉，并结扎。供肝50%减体积（将在下一节中介绍）后肝素化，再

9、在腹主动脉穿刺置管，对肝脏进行灌注，分离结扎切断幽门静脉、脾静脉和胃十二指肠静脉,缝扎肝固有动脉，远肝端切断，供肝取下，置于04生理盐水浴中。1.4 供肝的处理1.4.1 供肝的50%减体积本研究通过多次的预实验，采用 4次贯通穿刺、3次结扎和2回折的肝脏缝扎方法。具体为：整个缝扎过程使用带针的6-0 Prolene缝线，从操作者的右侧向左侧依次进行。在需要切除的肝叶的右侧1/3处从肝脏的脏面向膈面进针，贯通肝脏（1贯通）从右侧绕至进针点处打结（1结扎），保留缝线；向右侧折回（1回折），在第1针结扎肝的中间从膈面向脏面进针贯通肝脏（2贯通），再从另一面的脏面的左侧1/3处进针，贯通肝脏（3贯通

10、）与保留的缝线打结（2结扎）；向右侧折回（2回折），在第2针结扎肝的中间从膈面向脏面进针，贯通肝脏（4贯通）与保留的缝线在肝左侧膈面打结（3结扎）。其中，每次结扎都要收紧，但要避免缝线将肝组织切断，确实使结扎缝线环绕、阻断肝组织中的血管。本肝脏缝扎方法简称：4贯通、3结扎、2回折法，见示意图1、图2。由于做多环绕扣式缝扎，保留肝脏周边的变形皱折较少，见图3、图4。1.4.2供肝血管修整及套袖和支架的安装套袖自制，制作规格同Kamada，门静脉套管外径2.20 mm，内径1.80 mm，肝下下腔静脉套袖外径2.80 mm，内径2.50 mm自制袖管做成。所有修整安装过程均在冷生理盐水浴中操作。大

11、鼠50%供肝的门静脉和下腔静脉套袖安装和胆管支架安置方法与全肝移植相同，见图5 。1.5 受体手术受体自身肝脏切除与供体基本相同。完全游离右肾静脉水平以上的肝下下腔静脉，无损伤止血夹于右肾静脉上阻断肝下下腔静脉和断门静脉主干远端，此时受体鼠进入无肝期。经门静脉左右分支分叉处注入生理盐水2ml,用无损伤止血钳连同部分膈肌一起钳夹肝上下腔静脉，切除受体鼠自身的肝脏。将供肝从冷生理盐水浴中取出，原位置入受体腹腔。供肝外包裹4盐水纱布，摆正供肝的位置，用预置8-0缝线连续端端缝合肝上下腔静脉。在最后一针收口前用生理盐水冲洗管腔排尽气体。吻合管口冲洗排气将门静脉袖套插入受体门静脉腔内，环扎固定。松开门静

12、脉和肝上下腔静脉的阻断钳，结束无肝期。可见肝脏迅速充盈并恢复正常颜色。同法连接肝下下腔静脉。将供肝的胆道支架管插入受体的胆总管内固定后，外用大网膜包绕。所有管道吻合连接完毕后，可见位于受体大鼠的腹腔内的50%肝脏体积明显小于全肝，图6 。1.6 术后处理术后大鼠置于鼠笼内，单笼饲养，以普通照明灯提升动物体表温度，以便术后尽快复温，直至大鼠活动自如。动物苏醒后立即提供饮水和饲料，一般术后2小时起恢复饮水，6小时左右可恢复自主进食。1.7 结果的表达 本文的结果从技术技能的角度，主要采用图解和解说；对肝功能数据，采用统计学中的平均值和标准差的方法6表达。2 结果本实验每个实验组分为2小组，分2个阶

13、段，由同一操作者完成50%减体积原位肝移植。大鼠减体积肝移植与全肝移植相比较，在手术所花费的时间上有10分钟的延长，供肝的肝脏套袖、受体肝脏吻合等步骤没有不同。研究的结果的全部内容已有发表1。现将谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和胆红素（TBIL）的资料显示如下，见表1。在术后1-7天内，50%肝脏移植后的大鼠肝功能ALT、AST明显下降，向对照组的数值靠近，TBIL值与对照组逐渐相同。大鼠50%肝脏移植完成，植入肝色泽良好，结果见图3 。表1 手术组和对照组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和胆红素（TBIL）比较*Tab. 1 The data of ALT，AST an

14、d TBIL compared with the time by surgery and control group肝功能Liver function实验天数 组Days group ALT ( U/L )AST( U/L)TBIL( mol/L)(对照)(control)50%移植50% livergraft (对照)(control) 50%移植50% livergraft(对照)(control)50%移植50% livergraft1 daygrouppart 1(66.86.7)345.8 76.9(133.888.7)579.2118.1(3.601.14)3.830.98part

15、 2371.5100.4590.4120.93.830.763 daygrouppart 168.014.2165.243.13.671.63part 2105.278.3199.2142.83.671.515 daygrouppart 181.69.7149.264.13.601.52part 280.239.7170.884.03.801.107 daygroupgroup 186.69.6155.624.83.601.14part 292.69.0180.231.63.600.55* 结果采用统计学的均数和平均差的方法进行归纳。随着术后天数的延长，50%肝脏移植大鼠的ALT、AST明显下

16、降，向对照的数值靠近，TBIL值与对照组逐渐相同。* The results are summarized by the method of statistics of the mean and the mean difference. During the period of postoperative day, 50% of liver transplantation in the rat of ALT and AST decreased obviously to the same level of controlled group gradually; TBIL value is as

17、the same as the control group. 3 讨论国内夏穗生教授的研究团队对大鼠减体积肝移植有很好的研究2。其中他们的肝左侧叶的结扎切除方法是：看清肝中叶静脉和左侧叶肝静脉的汇合处，在其外侧洞穿左侧叶根部，带入2根1-0丝线，分别向左侧叶上下两缘结扎，再剪下左侧叶。在我们的研究中发现，减体积肝移植组近期并发症和主要死亡原因是肝脏切割面出血。同时发现，在肝脏结扎的时候最好是保持留用肝周边的自然张力，缝线不宜收得太紧。本研究采用相对较细的缝线，做多环绕扣式缝扎，将结扎的力分散，在肝叶切除后保留肝的变形较少。在一些预实验的基础上形成了我们的“4贯通、3结扎、2回折的肝脏缝扎方法”

18、。减体积肝移植手术由于手术过程中肝脏结扎边缘肝细胞的损伤，加之缺氧和肝脏缺血再灌损伤，必然不同程度地导致肝脏转氨酶类的释放，所以在肝细胞数量较少的情况下，最大限度地尽快恢复肝细胞功能是有益的选择。本方法对于从全肝移植技术熟练的人员转向50%肝脏移植，可能产生的出血、胆道并发症等技术问题不多，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）在术后3天开始迅速恢复，表明本研究使用的肝脏缝扎方法有动物恢复快的优点。这一技术在本单位对胸腺素T3加速肝脏再生1和促进肝脏缺血性损伤的恢复的研究中得到了应用7。由于正常SD大鼠的ALT、AST和TBIL的正常范围，在有关的实验动物书籍和论文中尚无参考值，本文主实验

19、1需要观察指标的设计时间较短，经对有关统计学6的学习，从统计学的“整体架构”中，认为用数据表格描述法，表达ALT、AST和TBIL比较合适。50%大鼠肝脏移植的生化指标，即便是同一操作者，由于动物的批次不同，以及实验外环境的细微差别等，也会产生一定的差异。不同的技术操作，由于操作人员的不同，是本文所提的“方法的技术优缺点不易评价”的原因。就本实验室而言，该方法已成为我们大鼠减体积肝脏移植的技术规范，认为值得应用推广。 图1 肝脏左外叶缝扎示意图 图2 肝脏左中叶缝扎示意图Fig.1 Diagram of left liver lobe suture Fig.2 Diagram of liver

20、 left middle lobe suture 图3 去除尾状叶和左外叶后的供肝 图4 去除尾状叶、左外叶和左中叶后的供肝Fig.3 The liver after removal of Fig.4 The liver after removal of caudatecaudate lobe and left lobe lobe , left lobe and the left middle lobe 图5 供肝的套袖和支架安装完毕 图6 移植完成Fig.5 Cuff and stand Installed Fig.6 50% liver transplantion completed 参考文献：1 Ahmed Taki-Eidin，Lin Zhou，Hai-yang Xie，et alTri-iodothyronine enhances liver regeneration after living donor liver transplantation in ratsJJ Hepatobiliary ancrea