可溶性型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备病毒性疫苗的免疫增强剂中应用

1、可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋I 型鸭性肝炎的免疫增强剂中的应用技术领域本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋I 型鸭性肝炎的免疫增强剂中的应用。背景技术鸭性肝炎（DVH），是由鸭肝炎（DHV）引起的雏鸭传染病，以肝脏性炎症为特征，表现为急性、高度接触性和致死性，在新疫区的率达 90%以上。临床特征主要表现为角弓反张（神经症状）、肝脏肿大并见大小不一斑。鸭肝炎属于小 RNA 病毒科（Picornaviridae）禽肝炎属（Avihepato有三个型，分别为 DHAV-1、），本DHAV-2 和 DHAV-3，无免疫交叉反应或免疫交叉反应弱。在我国，主要流行 1 型鸭炎。性肝

2、目前对 DHV 的控制主要依靠接种。虽然这些在控制鸭性肝炎方面起到了极大的作用，但也还存在诸多有待于改进和提高的方面，因此有必要开拓研究及防控的新领域。其中免疫增强剂的研究即是重要方向之一。所谓免疫增强剂是一类通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异性反应的物质。自 1925 年法国免疫学家兼兽医 Gaston Ramon 发现在中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应以来, 在医学和兽医学领域中，许多国家都不同程度地开展了这方面的研究。尤其是在工程技术飞速发展,工程不断开发以及生活水平日益提高的今天，一方面工程需要加入佐剂提高其保护率；另一方面公众健康意识日益

3、增强，免疫增强剂在医疗、方面的作用也越来越受到重视，因而免疫增强剂再次成为当代免疫学研究的热点。免疫增强剂可单独或与抗原同时使用，能够增强机体免疫应答的物质，可通过不同的作用方式增强机体的特异性和非特异性免疫应答。目前，免疫增强剂的种类繁多，主要有 5 类：微生物来源的药物（如卡介苗等）、生物因子类药物（如胸腺素、IFN- 等）、人工类药物（如左旋咪唑）、微量元素类（如硒、锌等）、天然类药物（如黄芪多糖等）。世界卫生组织（WTO） 对免疫增强剂有五项标准：（1）化学成分明确；（2）易于降解；（3） 刺1激作用适中；（4）无及致突变作用；（5）无毒性及不良反应。目前专门针对鸭的免疫增强剂，特别是

4、针对 I 型鸭肝炎的免疫增强剂较少。发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于提供可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋I 型鸭3D 蛋性肝炎的免疫增强剂中的应用；本发明的目的之二在于提供可溶性 I 型鸭肝炎预防 I 型鸭性肝炎免疫制剂中的应用。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：1、可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋I 型鸭性肝炎的免疫增强剂中的应用。优选的，所述免疫增强剂为细胞免疫增强剂或体液免疫增强剂。2、可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋预防 I 型鸭性肝炎免疫制剂中的应用。本发明中可溶性 3D 蛋白由如下方备：包括如下步骤：将 SEQ ID NO.3 所示序列的第91376 位核苷酸连接于 pET-3

5、2(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌 Rosetta、BL21或 BL21(DE3)PLYS 为宿主菌，在抗性的 LB 培养基中活化后，在 IPTG 终浓度为 0.21.0mmol/L、温度为 2039 条件下诱导表达 412 小时。其中宿主菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)PLYS；诱导表达的最佳条件为 IPTG 终浓度为 0.8 mmol/L、温度为 25条件下诱导表达 6 小时；活化的具体步骤为：将表达菌株接种于抗性的 LB 培养基中，在 37、120 r/min 条件下过夜培养，然后将培养液与培养至 OD600 为 0.6 即可。抗性的 LB 培养基按体积比为 1：100

6、扩大表达后还包括纯化步骤，具体如下：收集菌液，在 12000 r/min 条件下离心 10 min 后收集菌体，收集的菌体用 20 mmol/L、为 8.0 的 Tris-HCl 悬浮，然后在冰浴下超声，将破碎后的菌体在 4、12000r/min 条件下离心 10min，收集上清，上清用 Ni2+-NTA 琼脂糖凝纯化，透析，用 0.45 m 的滤膜超滤得纯化的可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋白。冰浴下超声最佳条件为在冰浴条件下超声破碎 6 次，30sec/次，每次之间间隔 30sec。本发明的有益效果在于：可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋I 型鸭性肝炎免疫增强剂中的应用，将可溶性 I 型鸭肝炎3D

7、蛋白单独免疫或与 I 型鸭性肝炎共免疫鸭后能够增加 CD8+ T 淋巴细胞数量，并且提高 IL-2、IL-4 和 IFN- 等细胞因子的含量，表明能够增强免疫鸭的细胞免疫和体液免疫力，同时经攻毒保护试验和解剖分析还可以得出免疫可溶性 I 型鸭肝炎3D 蛋白后还能降低免疫鸭攻毒后的病变和致死率，为免疫预防 I型鸭肝炎奠定了基础。2附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图 1 为 I 型鸭肝炎株 DHAV-H 的 3DPCR 扩增产物电泳结果（M：DL 2000Marker，1：3DPCR 扩增产物）。图 2 为I 型鸭肝炎株 DHAV-H 的 3D载体构建过

8、程中PCR 鉴定和酶切鉴定结果（A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D 质粒 PCR 鉴定，M：DL2000 Marker，1：PCR 产物；B： pJET-1.2+/DHAV-H-3D 质粒酶切鉴定，M：DL15000 Marker，1：Kpn/Xho双酶切条带， 2：Xho单酶切条带；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D 质粒的 PCR 鉴定，M：DL2000 Marker，1：PCR 产物；D：pET32a+/DHAV-H-3D 质粒的酶切鉴定，1：Kpn/Xho双酶切结果，2：Xho单酶切条带）。图 3 为可溶性 3D 蛋白表达条件的优化（M 为低分子量蛋白质标准品；A：表

9、达菌的筛选，1 为 pET-32(a)+空载体表达产物，2-4 分别为 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重组质粒转化 Rosetta、BL21 和 BL21(DE3)PLYS 三种不同表达宿主菌的表达产物；B：诱导表达时间的优化，1-5 依次为诱导 12 h、10 h、8 h、6 h 和 4 h 的 BL21(DE3)PLYS 宿主菌表达产物；C：诱导表达温度的优化，1-6 分别为 39、37、35、30、25和 20的 BL21(DE3)PLYS宿主菌表达产物；D：IPTG 浓度优化，1-5 分别为 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol

10、/L 和 1.0 mmol/L 的 IPTG 诱导的表达产物。图 4 为可溶性 3D 蛋白 Western-blot 检测及纯化蛋白电泳（A 为 3D 蛋白的免疫印迹检测结果，M 为蛋白质 Marker，1 为 3D 蛋白印迹。B 为 SDS检测纯化的 3D 蛋白，M 为低分子量蛋白质 Marker，1 为纯化的 3D 蛋白）。图 5 为攻毒的鸭及肝脏（A：攻毒鸭显著的角弓反张； B：攻毒鸭肝脏特征性）。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J. 萨姆等著）中所述的条件，或按照制造厂商所

11、建议的条件。实施例 1、克隆 I 型鸭肝炎株 DHAV-H 的 3DI 型鸭肝炎株 H（DHAV-H）（GenB：JQ301467）、E. coli DH5 菌种和 pET-32(a)+3载体均由禽病防治保存并提供。各种分子生物学试剂购于生物试剂公司。根据 DHAV-H 的引物如下：组序列（GenB：JQ301467）设计扩增 3D的引物，具体P1：5-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3（SEQ ID NO.1），下划线表示 Kpn酶切位点；P2：5-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3（SEQ ID NO.2），下划线表示 Xh

12、o酶切位点；然后将设计的引物由宝生物工程（大连）。取保存的 DHAV-H液以灭菌 PBS 作 5 倍稀释，添加 1/100 体积的双抗（青霉素、链霉素的终浓度分别为 100IU/mL 和 100g/mL）后于 37 温育 1 h，然后接种 9 日龄发育良好、无母源抗体的鸭胚，弃去 24 h 内胚，收集 2472 h胚的尿囊液及胚体，按照 Trizol 试剂盒将提取的提取RNA。cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反转录RNA 反转录和 PCR 扩增体系如表 1 所示。表 1反转录和 PCR 反应体系反转录程序为：30 10 min，42 15 min，95 5 min，4 5

13、 min，循环一次；PCR程序为：94预变性 5 min；94变性 40 sec，56退火 40 sec，72后延伸 30 sec，30 个循环，最后 72后延生 10 min。将 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图 1 所示。结果显示，扩增获得长度约 1386bp 的片段（不包括内切酶位点和保护性碱基为 1368bp），其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示，与预期片段大小相同，因此按照天根生化科技()的胶回收试剂盒回收目的条带，回收获得的片段命名为 DHAV-H-3D。实施例 2、构建表达 I 型鸭肝炎株 H 3D 蛋白的表达载体将回收的 DHAV-H-3D 与 pJET1

14、.2 载体连接，连接反应参照 pJET1.2 克隆试剂盒4RTPCR5*PrimescriptTM Buffer2 LPrimescript RTase Mix0.5 L下游引物P21 LRNA2 LRNAase Free 水4.5 L小计10 L2*Prime Star Mix12.5 L上游引物P1（10pmol/L）1 L下游引物P2（10pmol/L）1 LcDNA1 L灭菌蒸馏水9.5 L小计25 L进行，反应体系如表 2 所示。表 2、连接 DHAV-H-3D 与 pJET1.2 载体项目体积2Reaction Buffer DHAV-H-3D 回收产物 pJET1.2 载体水（n

15、uclease free） T4 DNA-ligase小计10 L1 L1 L7 L1 L20 L按表 2 体系混合后进行瞬时离心，然后在 20条件下连接 15 min。连接产物转化 DH5抗性的 LB 固体及液体培养基筛选，并将筛选菌落用 SEQ ID NO.1感受态细胞，并用和 SEQ ID NO.2 所示序列为引物进行 PCR 检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2 中 A 所示。结果显示，筛选获得了阳性克隆。为了进一步检测阳性克隆，将阳性克隆的菌株提取质粒，然后经 Kpn和 Xho双酶切及 Xho单酶切鉴定，酶切体系如表 3 所示。表 3、Kpn及 Xho酶切鉴定反应体系单酶切体

16、系双酶切体系10H buffer质粒2.5 L 10 L11.5 L/ 1 L25 L10H buffer质粒2.5 L 10 L10.5 L1 L1 L25 L灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水KpnXho小计KpnXho小计按表 3 体系混合后瞬时离心，然后于 37条件水浴 3h，反应结束将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 2 中 B。结果显示，DHAV-H-3D 片段正确连入 pJET1.2 载体中，并命名为 pJET-1.2+/DHAV-H-3D。将 pJET-1.2+/DHAV-H-3D 送 Invitrogen 公司筛选未突变的序列用于构建表达载体。，取正确的 pJET-1.2+/DHA

17、V-H-3D 和pET-32(a)+载体分别用 Kpn和 Xho进行双酶切，回收 3D及载体骨架，然后按表 4 所示体系进行连接。表 4、3D及载体骨架连接体系项目体积55.5 L 2 L7.5 L15 L目的pET32a+回收液2Ligation mix小计按表 4 体系混合后瞬时离心，然后于 16条件下过夜连接，得 pET-32(a)+/DHAV-H-3D质粒。连接产物转化 DH5 宿主菌，以抗性 LB 固体及液体培养基筛选，然后进行 PCR鉴定，结果如图 2 中 C 所示。然后将 PCR 鉴定为阳性的菌株用于提取质粒，并将质粒用Kpn和 Xho进行双酶切及 Xho进行单酶切，酶切产物进行

18、琼脂糖凝胶电泳，结果如图2 中 D 所示。由图 2 中 C 和 D 可知，3D及载体骨架正确连接。实施例 3、I 型鸭肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的表达表达宿主菌大肠杆菌（ Escherichia coli ） Rosetta 、大肠杆菌 BL21 和大肠杆菌BL21(DE3)PLYS 菌种均由禽病防治保存；含 I 型鸭肝炎株 H 3D蛋白的表达载体 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 由实施例 2 中构建；各种分子生物学试剂购于生物试剂公司。将实施例 2 获得的 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 质粒分别转化 BL21 、 Rosetta 和BL21(DE3)PLYS 表达菌

19、，转化菌于过夜培养，次日将过夜培养物与新鲜抗性的 LB 液体培养基中 37、120 r/min 条件下抗性的 LB 液体培养基按体积比为 1：100 扩大培养约 3 小时，菌液 OD600 达 0.6 时加入 IPTG 至终浓度为 0.2 mmol/L，并在 37下诱导12 h，然后收集菌液，将菌液在 12000 r/min 条件下、离心 10 min，菌体用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）按 1:10（V/V）悬浮。同时以 pET-32(a)+载体转化相应表达菌作为对照。为了筛选表达出可溶性 3D 蛋白的表达菌，然后将上述制得的悬浮菌液在冰浴条件下超声破碎 6 次，30sec

20、/次，每次之间间隔 30sec，然后将破碎后的菌液在 4、12000r/min条件下离心 10min，弃沉淀（为不溶性包涵体表达蛋白），收集上清（为可溶性表达蛋白）。吸取 80L 上清，加入 20L 含-巯基乙醇的 5SDS 上样buffer，煮沸 10min 后在 12000r/min条件下常温离心 5min，然后进行 SDS电泳检查，结果如图 3 中 A 所示。结果显示，通过将重组质粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 转化到三种表达菌后，在约 68 kD 处出现了目的条带，而对照不含有此条带，并且转化 BL21(DE3)PLYS 菌株的蛋白表达量最大、BL21的表达量次之，所以根

21、据表达量筛选出最佳表达菌为 BL21(DE3)PLYS。I 型鸭肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白表达条件的优化：（1）IPTG 浓度的优化：将含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重组质粒的 BL21(DE3)PLYS6菌株的菌液按体积比为 1:100 接种于 5抗性的 LB 液体培养基试管中，并于 37振荡培养至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至终浓度分别为 0.2 mmol/L、 0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L，然后在 37条件下诱导培养 12 h，然后用 SDS检测可溶性 3D 蛋白的表达量，结果如图 3 中

22、 B 所示。结果显示，IPTG 终浓度为 0.8 mmol/L条件下可溶性 3D 蛋白的表达量最高，即 IPTG 终浓度为 0.8 mmol/L 为最适浓度。（2）诱导表达温度优化：将含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重组质粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按体积比为 1:100 接种于 6抗性的 LB 液体培养基试管中，并于 37振荡培养至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，然后分别于温度为 20、 25、30、35、37和 39条件下诱导 12 h，然后用 SDS检测可溶性 3D 蛋白的表达量，结果如图 3 中 C 所示。结果

23、显示，温度在 25条件下可溶性 3D 蛋白的表达量最高，即诱导温度为 25为最适表达温度。（3）诱导表达时间优化：将含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重组质粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按体积比为 1:100 接种于 5抗性的 LB 液体培养基试管中，并于 37振荡培养至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，然后于温度为 25条件下诱导 4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h，然后用 SDS检测可溶性 3D 蛋白的表达量，结果如图 3 中 D 所示。结果显示，温度在诱导表达 6h 后可溶性 3D 蛋白的表达量以达到最高，

24、即诱导表达时间为 6h。经过上述优化，可以看出含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重组质粒的 BL21(DE3)PLYS菌最优表达条件为 0.8 mmol/L IPTG、25诱导 6 h。后续按照此条件对 3D 蛋白进行大量表达。I 型鸭肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白 Western-blot 检测，具体步骤如下：按最优表达条件表达可溶性 3D 蛋白，然后进行 SDS，随后将电泳后的凝胶转印至 PVDF 膜上，80 V 转印 90 min，转印完毕后将 PVDF 膜取出，以 1% BSA 于 37 摇动孵育 1 h，然后以1：100 稀释的抗 DHAV 的 IgG 在 37摇动孵育

25、 1 h 后取出，以 TBS 洗涤 3 次，每次 2 min，随后以 1：3000 稀释的 HRP 标记的二抗 IgG 于 37摇动孵育 1 h，以 TBS 洗涤后按照 DAB显色，待目的条带清晰可见时以蒸馏水冲洗终止显色，结果如图 4 中 A显色试剂盒所示，最后将 PVDF 膜干燥避光保存。I 型鸭肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的纯化：将含重组质粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 的BL21(DE3)PLYS 在最适条件下表达，然后收集菌体，用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）悬浮后在冰浴条件下超声破碎 6 次，30sec/次，每次之间间隔 30sec，然后将破碎后的

26、菌液在 4、712000r/min 条件下离心 10min，收集上清（为可溶性表达蛋白）；然后将收集的上清在 Bio-rad公司提供的 Ni2+-NTA 琼脂糖凝纯化（纯化液及纯化方法按试剂盒进行），将收集的纯化蛋白液进行透析后用 0.45m 的滤膜超滤，最后置于 4、-20、-70或冻干保存。将纯化后的可溶性 3D 蛋白进行 SDS电泳，结果如图 4 中 B 所示。结果显示表达的 3D 蛋白经 Ni2+-NTA 亲和纯化后，得到了纯度、浓度均较高的蛋白，经核酸蛋白分析仪测定蛋白浓度为 1.5 mg/mL。实施例 4、可溶性 3D 蛋白对 I 型鸭肝炎将鸭分为 3D 蛋白组（P 组）、3D 蛋

27、白+免疫鸭的细胞免疫增加作用组（P+V 组）、组（V 组）及对照组（C组），然后按照表 5 的免疫剂量和途径进行免疫和注射。表 5、动物分组及免疫组别动物数量免疫时间免疫途径及剂量3D 蛋白组（P）101 日龄皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鸭肝炎组（P+V）101 日龄皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒剂量鸭肝炎组（V）101 日龄肌肉注射,1 羽份对照组（C）101 日龄皮下，生理盐水免疫后 7 天采血，测定 CD8+ T 细胞亚群和免疫细胞因子，检测方法按照试剂盒进行，结果如表 6 所示。表6、CD8+ T 细胞亚群及细胞因子检测结果检 测对象组别PP+VVCCD8+ IL-2

28、 IL-4IFN-r0.2810.0300.2990.0280.2790.0100.2070.0320.2880.0290.3110.0280.2420.0210.2010.0180.2780.0270.2550.0230.2220.0190.1980.0250.2520.0340.2410.0930.200.1090.1570.032结果显示，免疫后 7 天各实验组的细胞因子水平均有所上升。由于细胞因子是由多种细胞所的小分子多肽，具有调节细胞生长分化、免疫功能，参与炎症发生和愈合等作用。根据免疫应答类型可将细胞因子分为Th1 型和Th2 型。Thl型有 IL-2、IFN-、肿瘤坏死因子（TN

29、F）和淋巴毒素（LT），主要由细胞介导的免疫应答反应过程产生。Th2 细胞因子由 B 细胞的激活过程产生，包括 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-l3。IL-2、IL-4 和 IFN- 均是重要的免疫指标。在免疫应答过程中，IL-2 是细胞免疫的初始8因子，诱导产生 干扰素，IFN- 又称免疫干扰素，是 T 细胞免疫的一个重要指标。IL-2 刺激 Thp 细胞向 Th0 细胞分化，Th0 细胞IL-2、IL-4、IL-5 和 IFN-，通常又以 IL-4 代表体液免疫水平，IFN- 代表细胞免疫水平，IL-4/IFN- 的比值可以反应Th2/Th1 细胞的平衡状态。IL-2、

30、IFN- 还是参与机体抗续存在和增殖，IFN- 能直接抑制免疫机制的重要细胞因子。IL-2 能维持免疫细胞的持。CD8+ T 淋巴细胞数量也是体现反应免疫水平的指标，CD4+和 CD8+两种细胞的含量也能反应抗原递呈的先后顺序，反应免疫激发的机制。故本实施例对 CD8+ T 淋巴细胞数量，IL-2、IL-4 和 IFN- 等细胞因子进蛋白对雏鸭免疫增强作用的基本数据。定，以获取 3D上述结果可以看出，CD8+的水平呈现出与细胞因子相似的变化趋势，表明在免疫后，机体的细胞免疫得到了激发。这几个因子的水平升高与 ELISA 抗体水平升高是相符的。P 组IFN- 的水平较其余三组高，表明3D 蛋白能

31、刺激机体产生较强的细胞免疫。对比P+V 组和V组，从IL-2、IL-4 的水平推测整体的免疫水平上看，3D 蛋白能增强的免疫能力，而IL-4上升的幅度不大，暗示 3D 刺激机体产生细胞免疫强于体液免疫。综上，激雏鸭增强细胞免疫及体液免疫，而且细胞免疫强于体液免疫。的 3D 蛋白能刺实施例 5、可溶性 3D 蛋白对 I 型鸭肝炎免疫鸭的体液免疫增加作用将动物分为 3D 蛋白组（P 组）、3D 蛋白+组（P+V 组）、组（V 组）及对照组（C 组），按照表 7 的免疫剂量和途径进行免疫和注射。表 7、动物分组及免疫组别动物数量免疫时间免疫途径及剂量3D 蛋白组（P）101 日龄皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鸭肝炎组（P+V）101 日龄皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒剂量鸭肝炎组（V