临床免疫学检验：流式细胞术

1、流式细胞术1.流式细胞术的基本原理（掌握）；2.流式细胞术的技术要点（掌握）；3.流式细胞术的临床应用（了解）；第一节、流式细胞术的基本原理流式细胞仪（FCM, Flow cytometer） 是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞术 （FCM, Flow cytometry） 用流式细胞仪测量液相中的悬浮细胞或颗粒的一种现代分析技术，可在细胞保持完整的情况下，精确、快速地对流动中的单个细胞进行分子水平的多参数、定量分析，并可对特定群体进行分选。流式细胞术的特点和分类分析对象：单细胞悬液或生物颗粒；分析/分选速度

2、：快速，20/10万个/秒；检测参数：多参数（两个散色光参数，多个荧光参数）；检测结果：精度高，准确性好应用：临床、科研流式细胞术的检测范围细胞结构大小粒度核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量钙离子，pH值，膜电位细胞功能细胞表面/胞内特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体细胞凋亡流式细胞术的基本工作原理根据待测细胞的生物学特性或细胞生化成分，选择特定荧光染料或与荧光染料耦联的多/单克隆抗体标记细胞，以激光作为激发光源，利用显微荧光光度测定技术、光电技术以及计算机技术测定流动相中单个细胞受激后的光信号来分析细胞的物理、生化、免疫、分子生物等多种特性，并可根据某些特征进行细胞

3、亚群分选。流式细胞仪主要构成系统流动室和液流驱动系统光学系统信号检测和数据分析系统细胞分选系统1.流动室和液流驱动系统液流系统将单细胞悬液样本聚焦在光源的中心处。鞘流技术：1. 样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。2. 进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。3. 在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。4. 流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推至流速最快的液流中。5. 颗粒以衡定的速度作匀速运动。2.光学系统1. 激发光源； 气冷式氩离子激光器 (488nm)、氦氖激光（633nm）、375nm近紫外激光2. 光速成形器；

4、 聚焦激光光束3. 滤光片； 选择不同波长的荧光信号激发光源滤光片长通滤光片（LP, longpass filter）短通滤光片（SP, shortpass filter）带通滤光片（BP, bandpass filter） BP500/503.信号检测和数据分析系统光电二极管光电倍增管（PMT, photomultiplier tube）4.细胞分选系统液滴偏转技术1. 超声振荡压电晶体片2. 脉冲发生器产生充电脉冲流式细胞仪的检测参数1. 散色光信号前向角散色光（FSC）: 入射激光的同向散射光信号,与细胞相对大小及其表面积相关。 侧向角散色光（ SSC）：入射激光90角的散射光信号，与细

5、胞粒度及细胞内相对复杂性相关。2. 荧光信号：特异荧光，自发荧光荧光素与特异抗体结合；荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强；散色光信号荧光信号线性放大 DNA, RNA 含量对数放大 细胞膜表面分子定量流式细胞术（quantitative flow cytometry，QFCM）利用浓度确定的荧光计数微球实现FCM的绝对定量分析。液相芯片技术（liquid chip tech，LP）流式微球阵列技术（cytometric beads array, CBA）将流式检测技术和芯片技术相结合。第二节、流式细胞术的技术要点单细胞悬液 的制备保存外周血、骨髓标本脱落细胞：灌洗液，体腔积液实体组

6、织细胞：新鲜，石蜡包埋样本培养细胞：悬浮，贴壁细胞深低温保存法醇类固定保存法醛类固定保存法选择荧光染料的基本原则必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发；激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内；荧光素光谱的重叠应当尽量减少；荧光标记荧光染料：PI, Hoechest 耦联荧光素的抗体：PE, APC, FITC, anti-CD3/19/56 anti-IFN-/il-4标记方法影响因素直接免疫荧光标记间接免疫荧光标记浓度：抗原抗体最适比温度：4度时间：30min pH值：最适，不同；固定剂 ：醛类、醇类；胞内/胞外染色；流式细胞仪的校准和质量控制1. 校准用已知散射光和荧光强度的

7、标准微球对光路、散射光灵敏度、荧光线性和灵敏度校准。2. 质量控制a. 样品制备：b. 对照设置：阴性对照、 阳性对照、同型对照、单阳对照c. 室内质控：同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。数据的采集1. 光路校正；2. 建立获取模版, 设定获取细胞总数；3. 利用未染色细胞(阴性管)调整仪器PMT电压;4.用同型对照调节本底染色背景；5.用单染色的细胞(单阳管)调节仪器补偿；6. 上样检测并采集数据；分析数据设门 (gating)： 1. 在细胞分布的散点图中指定一个区域，对其中的细胞

8、进行单参数或多参数分析。 2. 在线设门、离线设门 3. 线性门、矩形门、圆形门、任意形状门 数据的显示和分析单参数测量数据的显示和分析：单参数直方图1. 纵轴代表被测细胞的相对数量；2. 横轴代表荧光信号强度的相对值。双参数测量数据的显示和分析：双参数散点图横轴/纵轴分别代表一个荧光参数；每个点代表一个细胞。二维等高图、等密度图、假三维立体图多参数测量数据的显示和分析：利用设门技术通过单参数直方图和双参数散点图等进行分析。3.流式细胞术的临床应用：一、在临床血液学中的应用；二、在临床免疫学中的应用；三、在临床肿瘤学中的应用；四、在器官移植中的应用；五、在临床微生物学中的应用；一、在临床血液学

9、中的应用；1. 在白血病和淋巴瘤的免疫分型诊断中的应用； 形态免疫细胞（ MIC）分型，微量白血病细胞（MRD）的检查；2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断； 糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白: CD55/CD593. 在血小板功能及相关疾病检测中的应用；二、在临床免疫学中的应用；1. 淋巴细胞及其亚群: T淋巴细胞：CD3/4/8/45/29/25； B淋巴细胞：CD5/19/20/21/22； NK细胞：CD3/16/562. 淋巴细胞功能分析：CD25/CD69/CD71；胞内细胞因子的检测；3.免疫系统疾病的诊断：免疫缺陷病；AIDS，CD4/CD8比值; 强直，HLA-B27;三、在临床肿瘤学中的应用；1. 细胞周期与DNA倍体分析：G0/G1 S G