临床免疫学检验：衰老免疫与免疫学检验

1、衰老免疫与免疫学检验第二十六章衰老（aging，senescence）指生物体随着年龄增长在组织形态结构和生理功能等方面出现的一系列慢性、进行性和退化性变化，主要表现为机体对内、外环境适应能力逐渐减退以至丧失。机制复杂，涉及到基因程序性表达、细胞形态、数目改变、组织结构和器官调节功能变化；免疫系统的衰老出现最早，对人体影响最大，与疾病关系最密切，机体衰老的主要原因。免疫衰老（immunosenescence）免疫功能随着增龄而逐步发生减退与紊乱的现象，是由基因控制的免疫系统循序渐进的自然退化过程。表现为免疫识别和免疫应答能力减弱，以及免疫功能的紊乱。第一节衰老时免疫系统的表现一、免疫器官中枢免

2、疫器官：骨髓和胸腺；外周免疫器官：脾脏、淋巴结等结构萎缩与功能退化1、胸腺： T细胞分化成熟的场所，“衰老中心”。重量变化：新生儿1416g青春期35 45g 逐年缩小；基质细胞合成的胸腺素减少，表达的MHC分子密度降低；结果：前T细胞的分化、成熟过程受阻，免疫功能下降；2、骨髓红髓/黄髓比例随年龄增大而下降，造血干细胞减少，脂肪细胞增多；免疫细胞生成速率下降，3、外周免疫器官脾脏、淋巴结萎缩，二、免疫细胞数量与功能的变化（一）T淋巴细胞1、数量减少，功能降低，各亚群比例变化；数量减少(mm3)：5x103 2x1031.6x103 婴儿 青春期老年并伴随不成熟T细胞增多； 2、T细胞表面CD

3、分子的变化：CD4和CD8: 与MHC分子的非多肽区结合，增强T细胞抗原识别受体（TCR）与抗原提呈细胞或靶细胞的亲和力，并有利于激活信号的传递。衰老T细胞表面CD4/8分子密度较少CD28: 位于T细胞表面，与抗原提呈细胞上的CD80/CD86 (B7-1/2) 结合，为T细胞活化提供必须的协同刺激信号。来自CD28的T细胞活化第二信号的缺乏将导致免疫应答无能。T细胞老化的标志性变化是CD28-的T细胞增多，尤其CD8+T中CD28表达下降更为明显。CD28表达下降将导致T细胞对有丝分裂原反应下降，同时对凋亡刺激敏感。CD45: 白细胞共同抗原，具蛋白酪氨酸磷酸酶活性，可调节淋巴细胞内的信号

4、传导，介导淋巴细胞的活化。存在多种异构体，如CD45RO、CD45RA、CD45RB。在T细胞成熟和活化过程的不同阶段表达不同类型的异构体。 CD45RO记忆性T细胞，CD45RA 未受刺激的初始T细胞， CD45RB 调节性T细胞(Treg)老年人CD45RO+T比例增多, CD45RA+T比例减少,对未接触过的新抗原刺激的免疫应答能力下降。初始性T细胞减少，记忆性T细胞增加3、T细胞信号传导功能的变化Peptide- MHCTCR/CD4/8 CD80/86 CD28蛋白酪氨酸激酶（PTK）磷脂酶C- ( PLC- )磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）三磷酸肌醇（IP3）甘油二酯（DAG）丝裂原

5、激活的蛋白激酶（MAPK）DNA复制、靶基因转录、表达细胞膜和内质网上的Ca2+通道Ca2+ 钙调素(calmodulin) 钙调磷酸酶(calcineurin)转录因子 NF-AT 去磷酸根蛋白激酶C (PKC)NF-kB磷酸化入核 4、细胞因子的变化辅助性T细胞（Th）活化后产生的细胞因子中，Th1型细胞因子随年龄增加而减少，Th2型细胞因子随年龄增加而增多；IL-2下降最明显，同时血清中sIL-2R水平升高；IL-4增多，可导致多克隆B细胞激活，易导致自身免疫性疾病；外周血中炎症性细胞因子IL-6增多，易引起自身抗体和淋巴瘤发病率增加； 5、T细胞端粒长度变化端粒：染色体末端特殊结构，由

6、220kb串联的短片段重复序列（TTAGGG）n和一些结合蛋白组成，具有维持细胞分裂和保护染色体结构稳定、完整性的作用。端粒会随着DNA复制逐渐缩短，当端粒长度丢失到一定长度时，引起染色体变性，染色体间融合，细胞不再增生，从而进入老化或增生状态；（二）B淋巴细胞1、细胞数量：总数明显变化不大，但是CD5+B细胞数量相对增多，导致B淋巴细胞对T淋巴细胞依赖抗原（蛋白质抗原）刺激的应答能力明显下降，对非依赖型抗原（如脂多糖）的应答能力增强，分泌低特异性的IgM。2、血清免疫球蛋白：水平相对稳定或增高，但是类别发生改变，高亲和力抗体水平下降；感染性疾病发生率增高；3、自身抗体：水平增高（三）其他类型

7、免疫细胞功能变化1、NK细胞：杀伤活性无抗原特异性、不依赖抗体、无MHC限制性，主要针对肿瘤细胞、病毒感染细胞，总数下降；2、抗原提呈细胞：专职（树突状细胞、巨噬细胞和B细胞）、非专职（血管内皮细胞、上皮细胞、间质细胞等）表现出数量或者功能上的变化；3、红细胞：依靠细胞膜表面的补体受体CR1（C3bR、C4b、C2b）黏附补体-抗体-抗原复合物，促进吞噬细胞清除循环血流中的免疫复合物，防止其沉积引起的超敏反应性疾病，同时可促进补体成分的失活，从而防止补体过度活化引起的组织细胞损伤；CR1表达下降，细胞出现结团成串、变性、脱水现象；易发生免疫复合物沉积引起的超敏反应性疾病；红细胞通过末端毛细血管

8、能力下降，代谢产物无法有效清除，引起代谢复合物沉积，进而引起组织器官的衰老和病变。第二节、与老年人免疫异常相关的疾病一、老年人免疫异常的主要特点1、免疫缺陷和免疫异常增强同时存在，导致免疫功能紊乱；2、免疫防御和免疫监视功能下降，不能正常识别和清除病原体的侵袭；对肿瘤细胞的弱抗原丧失了识别能力，导致不能及时清除体内变异细胞；3、免疫自稳功能异常，对自身抗原免疫应答增强，产生多种自身抗体或自身反应性T淋巴细胞。二、老年人易患的免疫性疾病（一）、衰老性感染免疫活性细胞数量和功能降低，防御和杀伤病原微生物的效能减弱，易引发感染性疾病，同时由于其神经反应不敏感，导致患病后缺乏典型症状和特征，如无明显发

9、热。同时对疫苗免疫接种无效。（二）、老年性自身免疫病免疫功能失调引起外源抗原刺激后的特异性免疫应答能力减弱，对自身抗原的反应加强，导致自身抗体或自身反应性T细胞产生。抗核抗体、抗线粒体抗体、抗甲状腺抗体及类风湿因子增多；抗核抗体增多导致体细胞分裂能力降低类风湿关节炎、桥本甲状腺炎、恶性贫血、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮（SLE）、重症肌无力等。（三）、恶性肿瘤高发于5570岁的人；细胞毒性T细胞功能减弱，NK细胞数量减少；易发生多发性癌症；隐匿癌增多：无症状的潜伏肿瘤，发展缓慢，一般也非致 死病因；症状不典型：（四）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease,

10、AD）多见于老年人，以记忆力减退、认知障碍、人格改变为特征的渐进性中枢神经系统退行性疾病。病因复杂，发病机制尚不明确，但公认与衰老相关；脑组织内-淀粉样蛋白（amyloid protein, A）的产生与清除失衡有关， A大量聚集并沉积，产生神经毒性作用；AD的免疫机制：小胶质细胞第三节衰老的免疫学检验T细胞衰老是导致机体衰老和免疫衰老相关疾病的重要因素。一、T细胞的检测（一）T细胞数量及其CD表型1、T细胞总数；2、初始T细胞与记忆性T细胞的绝对数及其比值：CD45RA/CD45RO;3、CD28分子在初始T细胞上的表达程度；流式细胞术方法检测相关标记分子的荧光强度，评价T细胞的衰老程度；（

11、二）、细胞因子1、IL-2及IL-2R2、IL-1/、IL-6 、TNF- 3、ELISA（三）、细胞增生功能T淋巴细胞的增殖功能降低，对PHA刺激反应敏感性降低二、B细胞的检测（一）、B细胞及其亚群1、流式细胞术检测CD5、CD19、CD20;2、细胞总数变化不大，CD5+B细胞比例增高，代表B细胞介导的体液免疫应答下降；（二）、免疫球蛋白与自身抗体1、相对稳定，但是特异性抗体生成量减少，2、自身抗体水平，异常Ig 如RF升高三、衰老与端粒长度的检测端粒是染色体末端重复的核苷酸序列，能维持染色体在细胞分裂过程中保持完整的功能。其本身在细胞分裂的过程中会逐渐变短，相关研究结果表明端粒长度与人的

12、健康状况、寿命、疾病风险有关。DNA印迹法（Southern blot）、荧光原位杂交、流式细胞荧光原位杂交、定量PCR（一）、DNA印迹法Sample material: Cell cultures and other biological samplesProtocolStep 1: Digestion of genomic DNAPurified genomic DNA is digested by an optimized mixture of frequently cutting restriction enzymes. The enzymes have been selected

13、in such a way that telomeric DNA and sub-telomeric DNA is not cut. This is due to the special sequence characteristics of the repeats. Non-telomeric DNA is digested to low molecular-weight fragments.Step 2: Gel electrophoresis and Southern blottingFollowing DNA digestion, the DNA fragments are separ

14、ated by gel electrophoresis, then transferred to a nylon membrane by Southern blotting.Step 3: Hybridization and chemiluminescence detectionThe blotted DNA fragments are hybridized to a digoxigenin (DIG)-labeled probe that is specific for telomeric repeats, then incubated with a DIG-specific antibod

15、y covalently coupled to alkaline phosphatase. Finally, the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, CDP-Star. The average TRF length can be determined by comparing the signals to a molecular-weight standard. Hinf I/Rsa I（二）、荧光原位杂交、1、细胞培养制备处于有丝分裂中期的染色体涂片变性DNA 杂交（CCCTAAFITC/Cy3)n DAPI或PI负染荧光显微镜检测荧光信号(端粒定量)2、用肽核酸（PNA, peptide