DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤

1、实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.51g，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA可低于0.5g。溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng

2、（10-9g）或更少的DNA即可检出。DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。质粒DNA分子量一般在106107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8106。质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。本实验采用

3、限制性内切酶Hind 或EcoR 酶解DNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR 酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。同时通过与标准pBR322 EcoR 酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。除单酶解外，还可以进行双酶解和多酶解，通过对这些内切酶的琼脂糖凝胶电泳图谱的分析，对DNA主要酶解片段大小的数据进行逻辑推理，便可得出

4、该DNA分子内各主要片段的排列顺序，因此，DNA限帛性内切酶酶解图谱的构建，对于DNA序列分析，基因组的功能图谱、DNA的无性繁殖、基因文库建立等都是必不可少的环节。限制性内切酶酶解图谱也已应用于某些遗传疾病的诊断。试剂和器材试剂限制性内切酶 Hind和EcoR，标准pBR322，标准DNA（外购）。1.Hind 酶解缓冲液与商品酶一齐由厂家提供或按以下配方配制（10缓冲液）：100mmol/L Tris，pH7.4，100m mol/L MgCl2，1mg/mol BSA（牛血清 清蛋白）10m mol/L DTT(二硫苏糖醇)和0.5mol/L NaCl。称取1.21g Tris，0.95

5、g MgCl2，100mg BSA，0.15g DTT，2.92g NaCl，双蒸水溶解后，定容至100ml。EcoR 酶解缓冲液中的NaCl浓度改为1mol/L，其余同Hind 缓冲液。其他限帛性内切酶相应缓冲液参阅附录九（四）。2.酶反应终止液（100.1mol/L EDTA，20% Ficoll，0.25%溴酚蓝或橙G）称取3.72g EDTANa22H2O，20g Ficoll，0.25g溴酚蓝，溶解后定容至100ml。3.电极缓冲液（5TBE）0.45mol/L Tris，0.45mol/L 硼酸，0.01mol/L EDTA,pH8.3。称取10.88g Tris，5.52g硼酸，

6、0.74g EDTANa22H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用时，用蒸馏水水稀释10倍称为TBE稀释缓冲液（0.5TBE）4.溴乙绽（EB）染我贮存液（1mg/ml）将100mg溴乙绽溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。器材Eppendorf离心管（1.5ml，经消毒），电泳槽，电泳仪，凝胶塑料托盘（外购商品或自制，见图34.2）电泳样品槽模板（梳子），锥形瓶（100ml），小烧杯（50，100，250ml），橡皮膏，电热恒温箱，玻璃纸。操作方法一、DNA的酶解一般DNA的用量在0.51.0g内即可获得条带清蜥的电泳图谱。实验33碱裂解法制备的质粒DNA 20l

7、可以做2条电泳分析。取10l进行酶解，其余10l做不酶解对照。标准DNA和pBR322需根据购进商品的浓度加入0.51.0g。为了酶解反应进行完全，需要加入过量的酶液，酶量往往是DNA量的23倍或更多，并需同时加入各种限制性内切酶相应的缓冲液，最后用双蒸水补足至20l。取7只清洁、干燥、无菌的Eppendorf离心管，编号，按照表34.1，用移液枪加入各种试剂。此步操作必须非常仔细，认真，反复核对，保证准确无误。加样后，小心混匀，37保温12h，然后各小管内加入2l（1/10V）的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。表34.1 DNA酶解加样表管号1234567自提质粒DNADN

8、A（0.55g/l）pBR322(0.44g/l)1010110.51010限制性内切酶（10U/l）EcoR Hind 0.80.80.50.8酶解缓冲液EcoR Hind 2.02.02.02.0双蒸水补足至20l表内单位为l二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备（1）称取0.5g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入50ml TBE稀释缓冲液，沸水浴中（或高压消毒锅、微波炉）加热，直至琼脂糖完全熔化在缓冲液中，取出轻轻摇匀，避免产生泡沫。（2）用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平），将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（跑一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5

9、1mm的间隙。（3）待琼脂糖冷至65左右，取25ml小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.19.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置0.51h。（4）待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。（5）取下封边的橡皮膏，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，用TBE稀释液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡，接着再倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面23mm。三、加样用微量注射器将17号酶解后的样品液分别加入到胶板的加样槽内，每个槽（522.5mm）容积约为

10、25l，因此加样量不宜超过20l，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心插入加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。四、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）。当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。五、染色将电泳后的胶板小心推至0.5g/ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。六、观察

11、和拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，荧光在46h后减弱，因此初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱。观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。拍照时，照相机加上近摄接圈和红色滤光镜头，用全色胶卷，5.6光圈，曝光时间根据条带荧光的强弱进行选择，1060s。将电泳图谱底片适当放大为照片。七、制作测定分子量标准曲线在放大的电泳照片上用卡尺测量出DNA Hind 酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片

12、段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。DNA-Hind 酶解和DNA-EocR 酶解各片段大小见表34.2，表34.3。表34.2 DNA-Hind 酶解片段片段碱基对数目（kb）道尔顿（106）123.13015.029.4196.1236.5574.2644.3712.8452.3221.5162.0281.3270.5640.3780.1250.08表34.3 DNA-EcoR 酶解片段片段碱基对数目（kb）道尔顿（106）121.22613.727.4214.7435.8043.7345.6433.4854.8783.0

13、263.5302.13八、质粒DNA大小的测定将自提质粒DNA EcoR酶解和非酶解电泳图谱与标准pBR322 DNA EcoR 酶解和非酶解电泳图谱进行比较。同时测量出酶解后，自提和标准质粒线状DNA条带迁移距离，在上述标准曲线上，查出相应的分子大小，两者加以比较。根据以上这些实验结果，试对自提质粒DNA纯度进行分析。（1）制胶时，若没有现成的凝胶托盘，也可直接在合适大小的玻璃板上制胶。用橡皮膏将玻板四周围起来，形成一个框，将玻板置于水平板上，取两个文具夹分别夹住样品槽模板两端，并以夹子为支架将之垂直立于玻板距一端2cm处（图34.3），上下调节样品槽模板的位置，使样品槽模析各齿的下端应该与

14、玻板表面保持0.51mm的间隙，也可在样品槽模板下压2层普通滤纸以保持一定的间隙，一般能允许2层滤纸通过的间隙即较合适。（2）EB染色液亦可在灌胶前加入凝胶内，终浓度达到0.5g/ml。电泳后电极缓冲液即含有EB。注意事项（1）溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗和弃去。（2）为了使DNA完全酶解，需要加入适量、足够的酶液。太少反应不完全，太多则浪费。由于每次购进的酶浓度不可能相同，购进的DNA和pBR322浓度也不一样，因此，酶和DNA加入的体积不能固定，加样表中的量只能作为一个参考，合适的酶量应该通过预试验来确定。（3）DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制