基因工程的基本操作程序讲义

1、第二节基因工程基本操作程序第1页生长快、肉质好转基因鱼(中国)第2页 基因工程（DNA重组技术）是指按照人们愿望，进行严格设计，并经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新遗传特征从而创造出更符合人们需要新生物类型和生物产品。目标基因获取基因表示载体构建将目基因导入受体细胞目标基因检测与判定概念：第3页一、目标基因获取目基因： 主要是指编码蛋白质基因，比如，与优良品质相关基因，与生物药品和保健品相关基因，以及与工业所需酶相关基因，也能够是一些含有调控作用因子。获取目标基因方法：人工合成从基因文库中获得目基因PCR技术扩增第4页从基因文库中获得目基因1、概念: 将含有某种生物不一样基因许多D

2、NA片段，导入受体菌群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不一样基因，称为基因库。2、分类:基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)第5页基因组文库: 将某种生物体内DNA全部提取出来，选取适当限制酶，将DNA切成一定范围大小DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌群体中储存，每个受体菌都含有了一段不一样DNA片段，也就是说，这个群体包含了这种生物全部基因，叫做这种生物基因组文库。cDNA文库 假如用某种生物发育某个时期mRNA反转录产生各种互补DNA（也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物cDNA文库。第6页基因组文库构

3、建第7页 cDNA文库构建-反转录法： 以目标基因转录成信使RNA为模板，反转录成互补单链DNA，然后在酶作用下合成双链DNA，从而取得所需基因。目标基因mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目基因)第8页第9页第10页思考？1、怎样从基因文库中得到我们所需目标基因? 依据基因核苷酸序列，基因功效，基因在染色体上位置，基因转录产物mRNA，以及基因表示产物蛋白质等特殊性来取得目标基因。第11页利用PCR技术扩增目基因1、定义： PCR是多聚酶链式反应缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段核酸合成技术，经过这一技术，能够在短时间内大量扩增目标基因。2、原理： 它是利用DNA双链复制

4、原理，将基因核苷酸序列不停地加以复制，使其数量呈指数方式增加(约2n，其中n为扩增循环次数）。第12页3、基本前提： 要有一段已知目标基因核苷酸序列，方便依据这一序列合成引物。4、过程：（1）加热至9095，使双链DNA模板两条链 之 间氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚 合反应模板。(DNA变性）（2）将温度降至5560，使两种引物分别与 模板DNA一端互补序列互补配对。（退火）（3）将温度升至7075，在耐高温DNA聚合 酶催化作用下，使DNA链延伸。（延伸）第13页 是一小段单链DNA，作为DNA复制起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸出发点而起作用多核苷酸链.引物：

5、第14页利用PCR技术扩增目基因第15页PCR扩增仪第16页人工合成目基因 基因较小，核苷酸序列已知，能够利用DNA合成仪人工合成.第17页二、基因表示载体构建基因表示载体模式图抗生素抗性基因思考？ 将生物全部DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？ 表示载体构建使目标基因在受体细胞中稳定存在，而且以遗传给下一代，同时是目标基因能够表示和发挥作用。第18页基因表示载体组分目基因开启子：是一段有特殊结构DNA片段，位于基因首段，它是RNA聚合酶识别结合部位，有了它才能驱动基因转录mRNA。终止子：也是一段有特殊结构DNA片段，位于基因末端，使转录在这里终止。标识基因：是为了判定受体细胞中是否含有目标

6、基因，从而将含有目标基因细胞筛选出来。第19页载体与表示载体区分：二者都有标识基因 和复制原点两部分DNA片段。表示载体在载 体基础上增加了目标基因、开启子、终止子 三部分结构.用到工具酶：既用到限制酶切割载体，又 用到DNA连接酶将目标基因和载体拼接，两 种酶作用化学键都是磷酸二酯键.开启子、终止子对于目标基因表示必不可少.目标基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体方式携带进去。注意第20页三、将目基因导入受体A、将目基 因导入植物细胞农杆菌转换法（最惯用）基因枪法花粉管通道法第21页1、农杆菌转换法农杆菌：是一个在土壤中生活微生物，能在自然界感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植

7、物没有感染能力。原理： 当植物受到损伤时，伤口处细胞会分泌大量酚类化合物，吸引龙杆菌移向这些细胞，这时龙杆菌Ti质粒上T-DNA（可转移DNA)可转移至受体细胞，而且整合到受体细胞染色体DNA上。第22页转化过程第23页2、基因枪法原理：利用压缩气体产生动力，将包裹在金属颗粒表面表示载体DNA打入受体细胞中，使目标基因与其整合并表示方法。应用：单子叶植物，但成本较高第24页3、花粉管通道法第25页B、将目基因导入动物细胞1、方法：显微注射法2、步骤：（1）首先将含有目标基因表示载体提纯。（2）从雌性体内取出受精卵，采取显微注 射仪进行显微注射。（3）再将注射了目标基因受精卵，经胚 胎早期培养一

8、段时间后，再移植到雌 性动物输卵管或子宫内，使其发育 称为含有新现实状况动物。第26页第27页C、将目基因导入微生物细胞1、受体： 因为原核生物含有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等特点，所以。早期基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。2、导入方法：（1）首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一个能吸 收周围环境中DNA分子生理状态，这种细 胞称为感受态细胞。（2）将重组表示载体DNA分子溶于缓冲液与感受 态细胞融合，在一定温度下促进感受态细胞 吸收DNA分子，完成转化过程。第28页四、目标基因检测与判定1、受体细胞DNA是否插入了目标基因。2、目基因是否转录出了m

9、RNA。3、检测目基因是否翻译成蛋白质。第29页受体细胞DNA是否插入了目标基因1、方法：DNA分子杂交技术2、步骤：（1）将转基因生物基因组DNA提取出来。（2）制备一个含有目标基因DNA片段，在片 段上用同位素标识，作为探针。（3）使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂 交带，说明目基因已经插入染色体DNA 中。第30页目基因是否转录出了mRNA1、方法：分子杂交技术2、步骤：（1）将转基因生物mRNA提取出来。（2）制备一个含有目标基因DNA片段，在片 段上用同位素标识，作为探针。（3）使探针与mDNA杂交，如果显示出杂交带， 说明目基因转录出了mRNA。第31页检测目基因是否翻译成蛋白

10、质1、方法：抗原抗体分子杂交2、步骤：（1）将转基因生物蛋白质提取出来。（2）制备一个对应抗体，抗体用同位素标识。（3）使抗体与蛋白质杂交，如果显示出杂交 带，说明目基因已经形成蛋白质。第32页1、在已知某小片段基因碱基序列情况下，取得该基因最正确方法是A 用mRNA为模板逆转录合成DNA B 以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C 将供体DNA片段转入受体细胞中，再深入筛选D 由蛋白质氨基酸序列推测mRNA答案：B第33页2、以下高科技结果中，依据基因重组原理进行是（ ）我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻 我国科学家将苏云金杆菌一些基因移植到棉花内， 培育出抗虫棉 我国科学家经过返回式卫星

11、搭载种子培育出太空椒 我国科学家经过体细胞克隆技术培养出太空牛ABCD答案：B第34页3、镰刀型细胞贫血症病因是血红蛋白基因碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用酶是 （ ）A解旋酶 BDNA连接酶 C限制性内切酶 DRNA聚合酶解析：检测这种碱基序列改变需将被测基因从DNA上切下来进行扩增，该过程需要限制性内切酶。在扩增后，经过热变性即可使待测基因解旋成单链，与已知碱基序列贫血病基因制成DNA探针进行分子杂交，依据形成双链情况即可测知其碱基序列，此过程无需解旋酶，更不需要形成重组DNA分子所需DNA连接酶和基因转录所需RNA聚合酶。据以上分析可知，必须使用酶是C、限制性内切酶。答案：C第35页4、以下关于基因工程叙述，正确是（ ）A基因工程经常以抗菌素抗性基因为目标基因B细菌质粒是基因工程惯用运载体C为培育成抗除草剂作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体D通惯用一个限制性内切酶处理含目标基因DNA , 用另一个处理运载体DNA解析：基因工程经常以抗菌素抗性基因为标识基因；质粒是基因工程惯用运载体；通惯用同一个限制酶切割目标