蛋白质定向进化技术

1、蛋白质定向进化技术（DE technology of Protein）第1页蛋白质定向进化技术 DE（directed evolution of protein）始于上世纪70年代，最早一个例子是进化一个起源于大肠杆菌 E b g A蛋白， 这个酶几乎不具备 -半乳糖苷酶活性。经过以乳糖为单一碳源平板上筛选 L a c- 缺失大肠菌株 ，野生型 E b g A就进化成为了含有 - 半乳糖苷酶活性酶。第2页蛋白质定向进化技术定义（definition）原理（theory）随机突变策略（marked features）定向进化选择策略（methods）应用及展望（application and p

2、rospects） 第3页蛋白质定向进化技术定义 定向进化技术是一个在生物体体外 ( 试管中) 模拟达尔文进化 ，利用自然选择动力进化出在自然界并不存在或是含有更优性质蛋白。第4页蛋白质定向进化技术 生物在漫长时间里经过自发突变（突变与重组），经过自然选择，逐步形成了多样性生物。自然选择自发、不定向、自然选择、慢分子定向进化 基因在短时间内经过人为引发突变，经过人工筛选，形成满足人们需要新功效或者优良性能生物物质（酶蛋白）人为、定向、人工选择、快第5页蛋白质定向进化技术原理DE原理是对目标基因进行突变、重组、表示和筛选,在试管内模拟蛋白质自然进化过程, 获取人们需要、含有特定性质和功效蛋白质。

3、定向进化=随机突变+选择第6页 随机突变策略易错 PCR DNA改组和外显子改组 杂合蛋白质体外随机引发重组交织延伸第7页蛋白质定向进化技术易错 P C R易错 P C R是指经过改变 P C R反应 条件，如： 调整反应体系中4种 d NTP浓度、增加Mg 2+ 浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，刷出所需突变体。易错 P C R关键是控制D N A突变频率。第8页蛋白质定向进化技术DNA改组 DNA改组又称有性PCR，目标是创造将亲本基因群中突变尽可能组合机会，造成更大变异，最终取得最正确突变组合蛋白质。第9页蛋白质定向进化技术杂合蛋白质 把不一样蛋白质分子结构单

4、元或整个蛋白质分子进行组合或交换，以产生含有所需性质优化蛋白质杂合体。第10页蛋白质定向进化技术体外随机引发重组 以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不一样位点短DNA片段，因为碱基错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少许点突变，在随即PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整基因长度。第11页蛋白质定向进化技术交织延伸 一个简化 D N A 重组方法，它不是由短片段组装全长基因，而是在 PCR反应中，将含不一样点突变模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸片段能够随机地杂交到含不一样突变模板上继续延伸，因为模板转换

5、而实现不一样模板间重组，如此重复直至取得全长基因片段。第12页定向进化选择策略 Venekei等人报道了有效快速筛选蛋白水解酶突变体方法和筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色和X-光片毁灭分析加以验证，并检测其活力快速筛选了44000个突变株。Roberts等人用嗜菌体表面展现技术筛选与嗜中性酯酶结协力更强抑制剂。从含有4900个突变体基因库中，取得与该酶结合能力高于野生蛋白质3600000倍突变体，比已报道任何一个对应抑制剂高50倍。第13页定向进化展望 不但能使蛋白质进化出非天然特征，还能定向进化某一代谢路径；不但能进化出含有单一优良特征蛋白质，还可能是已分别优化蛋白质两

6、个或多个特征叠加，产生含有多项优化功效蛋白质，进而发展和丰富蛋白质资源；完全在试管中进行蛋白质体外定向进化使在自然界需要几百万年进化过程缩短至几年。第14页蛋白质定向进化应用及展望提升酶催化活性 提升酶稳定性 改变酶底物特异性 改变对映异构体特异性第15页蛋白质定向进化技术提高酶催化活性 Shim 等采取定点突变技术构建突变体 ，改变了位于酶活性中心 “蛋白-s -结合 ” 口袋中 Me t -3 1 7 ，并突变为Ala ，从而有利于底物范围扩大； Potocki Veronese等利用易错 P C R和 DNA 重组技术对其 进行突变 ，得到催化蔗糖活性提升 6 0 突变体 A s n 3

7、 8 7 A s p ，从而扩大其应用范围，在实际生产中含有主要意义 。第16页蛋白质定向进化技术第17页蛋白质定向进化技术提升酶稳定性 Xiao等利用序列比正确结果为指导，进行定点突变 ，得到突变体 Tm值提升了 6 ，同时在不影响原有催化活性基础上，在 45 时半衰期比原酶提升了23倍之多。 Miyazaki 等为了适应生产化需要 ，综合了随机突变、定点饱和突变和 DN A 重组方法 ，将 11家族木聚糖酶进行改造以提升其热稳定性。最终得到突变体半热变性温度从 58 提升到 68，最适温度也从 55 升到了 65 ，同时在 60 热稳定性也显著增强。第18页蛋白质定向进化技术改变酶底物特异

8、性 Manu等经过对纤维二糖磷酸化酶 (CP) 进行易错 P C R筛选 ，得到突变株作用底物从传统纤维二糖转变成了乳糖 ，随即提升了乳糖磷酸化酶活性。最终得到突变体菌株乳糖磷酸化酶活性比原酶高出了1 0倍 。 第19页蛋白质定向进化技术 改变对映异构体特异性（1）Schmidt 等选取易错 P C R技术未起源于 Pseudomonas fluoresce 酯酶对应选择性野生型E值从 63提升至 96 ，同时活性也对应增加了， 能够到达 2 mi n转化 50 底物， 相当于 125 Umg 蛋白量。第20页蛋白质定向进化技术（2）1998年，Arnold等利用易错PCR和饱和诱变 方法 ，

9、成功地使一株倾向于 D -型底物乙内酰脲酶发生转变 ，使之变为倾向于 L - 型底物，经过分析这种转变只生发了一个氨基酸替换 。与野生型催化蛋白相比，增加了 L - 甲硫氨酸产量，降低了无须要产物积累。第21页实际用途在新药和疫苗开发中应用在改进单链抗体亲和力方面应用在酶制剂改造中应用构建大型文库和获取分子有力工具在化学品生物转化中应用 第22页蛋白质定向进化技术第23页蛋白质定向进化技术 Luginbuhl等用易错 PCR 和 DNA改组方法, 进行了几个回合 DE和用核糖体展示抗体库技术进行筛选后发觉, 得到抗体与朊病毒肽链非结构化区域亲和力增加.第24页蛋白质定向进化技术 Kikuchi 等借助DNA改组方法提升了根癌农杆菌 N-氮基甲酰D-氨基酸酰胺水解酶氧稳定性和热稳定性，使 N-氨基甲酰-D