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文档简介
1、外源性残留量检测目的描述外源性残余量检定(地高辛法)的操作过程和注意事项。目材料及设备2目试1剂试液无水乙醇。饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。吐温。十二烷基硫酸钠()溶液,用盐酸调至目。2乙二胺四乙酸二钠溶液()。醋酸钠溶液。0溶液:柠檬酸钠调至目,用固体调目III,L缓冲液(:量取溶液()溶液/)加灭菌水至。内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)目材2料和用具细菌基因组提取试剂盒(天根生物)批号琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物)批号外源残留量检测试剂盒()货号:458和32119尼龙膜(微米)点样器()、移液器、头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒、离心机、三维旋混仪、
2、电磁炉操作原理用随机启动法,将地高辛貳元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记,通过一个手臂将与载体半抗原地高辛貳元连接起来()。与目的杂交后,杂交分子用酶联免疫法检测;应用抗体酶联接物(抗地高辛甙元碱性磷酸酶复合物)和随后用酶促颜色反应使一溴一一氯一一吲哚磷酸(I和氮蓝四唑()显色。流程图基因组探针标记纯化探针_k探针效率确定预杂交一杂交过夜.操作过程探1针制备提.取1后的基因组用等体积的饱和酚溶液(饱和酚:三氯甲烷:异戊醇)混合均匀,离心(C)分钟。轻轻吸取上层液体到另管,在上清液中加入1/1体0积乙酸钠,稍微震荡或轻弹混匀,然后加入倍体积(加入乙酸钠后的体积)冰无水乙醇,混匀后置于C小时或C小时
3、。离心(C)分钟,弃液体,加入冰乙醇离心(C)分钟,弃去液体,室温晾干。加入适量无菌水或缓冲液,C保存。纯化后的基因组进行酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收小片段。取M回收用灭菌双蒸水加至微升,然后放入沸水浴中将变性,水浴分钟后,立即放入冰水浴中,冰浴分钟。冰浴后加入试剂盒中的试剂微升,轻轻摇晃混匀,C培养过夜。次日,将探针取出,向其管内添加乙二胺四乙酸二钠溶液()微升,醋酸钠溶液微升,无水乙醇微升。将管放于C环境中小时以上。取出探针,离心(C)分钟,倾倒上清,用微升灭菌双蒸水溶解探针,放于C环境中备用(不宜超过一周)。.供2试品,阳性,阴性及对照处理用纯化后的基因组,稀释梯度为/J、|J1
4、|J1M、J的阳性对照。阴性对照为稀释液。将供试品、阳性对照、阴性对照置C水浴加热分钟,迅速冰浴冷却分钟,以转分离心秒甩水。.点3膜及杂交用抽滤加样器将M样品全部点样于的杂交膜上。取下杂交膜,点样面向上,置紫外灯下照射分钟。取无菌培平皿,加已预热(C)杂交液,并将杂交膜全部浸泡于其中,置水浴孵育分钟进行预杂交。预杂交完毕后,倒掉预杂交液加入新鲜预杂交液(C)及全部探针(探针置C水浴加热分钟,冰浴分钟),然后置C水浴孵育过夜。4.洗4脱及显色低严谨性洗脱:取无菌培养平皿,加(含)将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床,洗2次,每次分钟。高严谨性洗脱:取无菌培养平皿,加C预热将杂交液全部浸泡其
5、中,置8摇动,洗2次,每次分钟。平衡:取无菌平皿,加(含吐温0将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床震荡。封闭:取一次性无菌培养平皿,加稀释过的封闭液,将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床震荡分钟。抗体孵育:取一次性无菌培养平皿,加稀释过的封闭液,同时加入试剂盒中的4#试剂2微升,将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床,30分钟。洗脱:取一次性无菌培养平皿,加(吐温0将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床,分钟,2次。平衡:取一次性无菌培养平皿,加,将杂交膜全部浸泡其中,室温下置水平脱色摇床,5分钟。显色:取一次性无菌培养平皿,加(含|J#,将杂交膜全部浸泡其中,室温下避光静置小时以上至显色完毕。终止反应:将杂交膜置无菌水中5分钟。湿膜扫描、风干并封膜。结果判定阳性对照应显色,其颜色深
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