外源性DNA残留量检测

1、外源性残留量检测目的描述外源性残余量检定（地高辛法）的操作过程和注意事项。目材料及设备2目试1剂试液无水乙醇。饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。吐温。十二烷基硫酸钠（）溶液，用盐酸调至目。2乙二胺四乙酸二钠溶液（）。醋酸钠溶液。0溶液：柠檬酸钠调至目,用固体调目III,L缓冲液（：量取溶液（）溶液/）加灭菌水至。内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）目材2料和用具细菌基因组提取试剂盒（天根生物）批号琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生物）批号外源残留量检测试剂盒（）货号：458和32119尼龙膜（微米）点样器（）、移液器、头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒、离心机、三维旋混仪、

2、电磁炉操作原理用随机启动法，将地高辛貳元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记，通过一个手臂将与载体半抗原地高辛貳元连接起来（）。与目的杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测；应用抗体酶联接物（抗地高辛甙元碱性磷酸酶复合物）和随后用酶促颜色反应使一溴一一氯一一吲哚磷酸（I和氮蓝四唑（）显色。流程图基因组探针标记纯化探针_k探针效率确定预杂交一杂交过夜.操作过程探1针制备提.取1后的基因组用等体积的饱和酚溶液（饱和酚：三氯甲烷：异戊醇）混合均匀，离心（C）分钟。轻轻吸取上层液体到另管，在上清液中加入1/1体0积乙酸钠，稍微震荡或轻弹混匀，然后加入倍体积（加入乙酸钠后的体积）冰无水乙醇，混匀后置于C小时或C小时

3、。离心（C）分钟，弃液体，加入冰乙醇离心（C）分钟，弃去液体，室温晾干。加入适量无菌水或缓冲液，C保存。纯化后的基因组进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收小片段。取M回收用灭菌双蒸水加至微升，然后放入沸水浴中将变性，水浴分钟后，立即放入冰水浴中，冰浴分钟。冰浴后加入试剂盒中的试剂微升，轻轻摇晃混匀，C培养过夜。次日，将探针取出，向其管内添加乙二胺四乙酸二钠溶液（）微升，醋酸钠溶液微升，无水乙醇微升。将管放于C环境中小时以上。取出探针，离心（C）分钟，倾倒上清，用微升灭菌双蒸水溶解探针，放于C环境中备用（不宜超过一周）。.供2试品，阳性，阴性及对照处理用纯化后的基因组，稀释梯度为/J、|J1

4、|J1M、J的阳性对照。阴性对照为稀释液。将供试品、阳性对照、阴性对照置C水浴加热分钟，迅速冰浴冷却分钟,以转分离心秒甩水。.点3膜及杂交用抽滤加样器将M样品全部点样于的杂交膜上。取下杂交膜，点样面向上，置紫外灯下照射分钟。取无菌培平皿，加已预热（C）杂交液，并将杂交膜全部浸泡于其中，置水浴孵育分钟进行预杂交。预杂交完毕后，倒掉预杂交液加入新鲜预杂交液（C）及全部探针（探针置C水浴加热分钟，冰浴分钟），然后置C水浴孵育过夜。4.洗4脱及显色低严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加（含）将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，洗2次，每次分钟。高严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加C预热将杂交液全部浸泡其

5、中，置8摇动，洗2次，每次分钟。平衡：取无菌平皿，加（含吐温0将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡。封闭：取一次性无菌培养平皿，加稀释过的封闭液，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡分钟。抗体孵育：取一次性无菌培养平皿，加稀释过的封闭液，同时加入试剂盒中的4#试剂2微升，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，30分钟。洗脱：取一次性无菌培养平皿，加（吐温0将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，分钟，2次。平衡：取一次性无菌培养平皿，加，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，5分钟。显色：取一次性无菌培养平皿，加（含|J#，将杂交膜全部浸泡其中，室温下避光静置小时以上至显色完毕。终止反应：将杂交膜置无菌水中5分钟。湿膜扫描、风干并封膜。结果判定阳性对照应显色，其颜色深