动物细胞工程制药 (4)讲稿

1、关于动物细胞工程制药 (4)第一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第一节 概述第二节 动物细胞的形态和生理特性第三节 生产用动物细胞的要求和获得第四节 动物细胞的培养条件和培养基第五节 动物细胞培养的基本方法第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式第七节 动物细胞生物反应器第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节 动物细胞制药的前景与展望第三章 动物细胞工程制药第二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月培养细胞的种类 原代细胞培养 传代细胞培养培养基不同 液体培养 固体培养培养容器和方式不同 静止培养 旋转培养 微载体培养 中空纤维培养 固定化培养第五节 动物细胞培养的基本方

2、法第三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、细胞分离1、离心分离法：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，8001000 r/min离心510min2、消化分离法：将生物体的组织块剪碎用消化液消化，使组织松散成细胞悬液用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液获得所需细胞第四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月消化液的用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。常用的消化液：胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等第五张，PPT共七十一页，创作于2022年

3、6月二、细胞计数1、自动细胞计数器计数原理：让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。优点：计数速度快缺点：无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团记录为单个细胞，使计数值偏低第六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2、血球计数板计数第七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月酚蓝染色：死细胞呈蓝色苯胺黑染色：负染色法，细胞本身不染色2、血球计数板计数第八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3、结晶紫染色细胞核计数法原理：结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，

4、可使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。第九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月4、MTT染色计数法MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶，可溶于二甲亚砜（DMSO）。 MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在490nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。灵敏度高；MTT有致癌性，DMSO极易渗透皮肤。第十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月三、细胞传代悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，

5、然后分种两只或多只培养瓶贴壁细胞的传代：先消化再分种第十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月贴壁细胞传代的注意事项消化前确定细胞有无污染加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可消化时间不宜过长，室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以20-30万个/ml，每次1传2或1传3为宜；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次二倍体细胞每次传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，3-5d传代一次第十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月四、细胞的冻存和复苏1、细胞的冻存采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如甘油

6、和二甲亚砜；冷冻速度以1/min的速度下降为宜注意事项：冻存前一天换液培养；细胞密度以1-2106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。第十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2、细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：操作中注意防护，戴面罩和手套；从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；用乙醇消毒安踣外表；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞大规模培养的方法二、动物细胞培养的操作方式第六

7、节 动物细胞大量培养的方法和操作方式第十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类： 原代培养 传代培养依培养基： 液体培养 固体培养第十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月依培养容器和方式： 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养 中空纤维培养、 固定床或流化床培养从生产实际分为： 悬浮培养 贴壁培养 贴壁-悬浮培养第十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1、悬浮培养 即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培

8、养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验；可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低第十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5%CO2的无菌空气，保持细胞悬浮状态并维持培养液溶解氧和pH。不同细胞悬浮条件不同。为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持p

9、H值，若使用HEPES缓冲盐溶液可不必连续通入含5%CO2的空气。第十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月悬浮培养的反应器第二十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2、贴壁培养 是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。第二十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3、贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）微载体培养包埋和微囊培养结团培养第二十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6

10、月（1）微载体培养 将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，或称微珠培养法。 制备微载体的材料主要有： 葡聚糖 明胶 玻璃 纤维素等第二十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月微载体培养的优点： 既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。第二十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月理想微载体需具备的条件微载体表面性质与细胞有良好的相容性；微载体的材料无毒性；微载体的材料是惰性材料；材料比重为1.030

11、-1.045 g/ml；粒径60-250 m（溶胀后），大小均一；具有好的光学透明性；基质的性质是软性的；可耐120 高温，便于采用高压蒸汽灭菌原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用第二十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月从固体微载体发展到多孔微载体（porous microcarrier）或多孔微球：极大增大了供细胞贴附的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养。第二十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（2）包埋和微囊培养包埋法：将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中微囊法：由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊可用于包埋细胞的载体材料：人工合成的高

12、分子聚合物（聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖类（如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、海藻酸钙、壳聚糖等）、蛋白质（如胶原、明胶、纤维蛋白等）第二十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月包埋或微囊培养法的优点包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108 个/ml以上。当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。可采用多种生物反应器进行大规模培养。第二十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月包埋或微囊培养培养装置第二十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月中空纤维培养器优

13、点第三十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月（3）结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养，可获得高密度的细胞。优 点：操作简便，节省了用于微载体的成本。第三十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、动物细胞培养的操作方式分批式操作补料-分批（或流加式）操作（细菌生产中常用）半连续式操作连续式操作（个别情况下用于悬浮细胞的培养）灌流式操作第三十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1、分批式操作将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。先

14、将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。第三十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2、半连续式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。优点：操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。第三十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3、灌流式操作定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形

15、成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。第三十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。灌流式操作的优点第三十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞生物反应器的类型二、动物细胞生物反应器的检测控制系统三、培养条件的控制第七节 动物细胞生物反应器第三十七张，PPT共

16、七十一页，创作于2022年6月生物反应器必备条件制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的均一第三十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月可长期连续运转容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于操作维修设备成本尽可能低生物反应器必备条件第三十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月按规模大小可分

17、为：实验室规模：20L，用于培养工艺的研究;中试规模：20100L，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验;生产规模：100L，用于生产，提供产品。动物生物反应器第四十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞生物反应器的类型搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器透析袋或膜式生物反应器中空纤维生物反应器固定床或流化床式生物反应器CellGen plus生物反应器第四十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1、搅拌罐式生物反应器第四十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2、气升式生物反应器第四十三张，PPT共七十一页，创作于2022

18、年6月3、透析袋或膜式生物反应器第四十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月4、中空纤维式生物反应器第四十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月5、固定床或流化床式生物反应器第四十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月6、CellGen plus生物反应器第四十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、动物细胞生物反应器的检测控制系统培养过程中需检测的物化参数：有些需要在线检测，如温度、pH、搅拌速度、溶氧等；有些则需要取样离线检测，如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在检测后计算后才能获得，如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率

19、、乳酸产率、生物反应器生产率等。第四十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 动物细胞对搅拌引起的剪切力和气泡很敏感，要保持所需的溶氧很困难，常采用的措施有：改变进气的组成：不同比例的O2、N2、CO2和空气加大通气流量适当提高转速在反应器外通气加入血红蛋白适当提高罐压第四十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月三、培养条件控制动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，还需添加抗生素，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。在分批培养时，随细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需要更换培

20、养液或移植继代培养。第五十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度。动物细胞对环境变化适应能力较微生物细胞小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的控制第五十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺第五十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞产品常用的纯化方法二、动物细胞产品的质量要求第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求第五十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月下游纯化工作费钱、难度大成分复杂：工程细胞表达的产品，常常和细胞内

21、容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开作用于人体的药物纯度要求高：由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高第五十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月大多数动物细胞表达的产物产量低，生物活性不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器。由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种

22、产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。第五十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、动物细胞产品常用的纯化方法离心（低温离心）离子交换层析凝胶层析亲和层析盐析和有机溶剂沉淀透析高压液相层析第五十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月盐析和有机溶剂沉淀盐析：溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和pH常同时使用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。有机溶剂沉淀：加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质变性必须在低温下操作。第五

23、十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月透 析原理：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。第五十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月高压液相层析（HPLC，high-pressure liquid chromatography） 使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。 柱效比经典柱色谱柱高。在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的监测器，以及自动描记、分布收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。 第五十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、动物细胞产品的质量要求对工程细胞的要求：有细胞系的历史资料有

24、细胞特性的资料无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染第六十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求：对生产厂房、原材料和试剂的要求对细胞培养的要求对纯化过程的要求第六十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月产品纯度产品生物活性产品比活性：每毫克蛋白质中含有多少单位生物学活性（U/mg）产品蛋白质性质的鉴定产品中杂质的检测产品的稳定性产品临床前的安全性和有效性评价产品临床试验的安全性和有效性评价对产品的质量要求：第六十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、改进表达载体，提高表达水平和产量二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本三、抑制细胞凋亡，延长培养周期四、采用糖基化工程，提高产品质量五、转基因动物的研究六、组织工程的研究第九节 动物细胞制药的前景与展望第六十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月一、改进表达载体，提高表达水平和产量采用更强的启动子和增强子更好的利用扩增系统或寻找高表达位点采用和改造更好的宿主细胞第六十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月二、利用代谢工程，改进培养