rna干扰完整解析

1、rna干扰完整解析rna干扰完整解析第1页RNA干扰 RNA干扰是什么 RNA干扰发觉 RNA干扰作用机制 RNA干扰应用RNA干扰RNA干扰存在问题rna干扰完整解析第2页什么是RNA干扰？英文：RNA interference，缩写RNAi 。概念：是指在进化过程中高度保守、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发、同源mRNA高效特异性降解现象，是正常生物体内抑制特定基因表示一个现象 rna干扰完整解析第3页RNA干扰发觉 ，安德鲁法厄与克雷格梅洛（Craig C. Mello）因为在RNAi机制研究中贡献取得诺贝尔生理及医学奖。rna干扰完整解析第4页19

2、95199219911990Napoli 等尝试在有颜色矮牵牛( Petunia hybrida ) 花翼瓣中经过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表示, 来加深花瓣颜色。出人意料是, 花瓣颜色不但未加深,而且42%介入 CHS 基因植物花全部变白或有白色或灰白图案。Fire 等把 RNA 注入新秀杆线虫以控制基因表示Guo和Kemphues在线虫中也发觉了RNA干扰现象。罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发觉了外源导入基因能够抑制含有同源序列内源基因表示rna干扰完整解析第5页19991998 美国华盛顿卡耐 基研究院 Fire等在研究 RNA 干扰所需结构和传递条件试验中发

3、觉, 把 dsRNA 正义链和反义链混合物注入线虫体内, 比注入单独任意一个正义链或反义链效果均要好。Hamilton等首次在PTGS植株中发觉了长度为25ntRNA中间产物。，Zamore和Hammond等使用体外培养果蝇细胞进行研究发觉，外源性dsRNA经过耗能过程降解成21-23nt小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引发RNAi。Brummelkamp等首次使用小鼠H1开启子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表示载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目标基因表示，为利用RNAi技术进行基因

4、治疗研究奠定了基础。Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。，Elbashir等证实21ntsiRNA可在防止激活dsRNA依赖蛋白激酶和2,5-寡聚腺苷酸合成酶信号转导路径同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目标基因表示。rna干扰完整解析第6页RNAi作用机制 RNAi机制和过程大致分为以下几个阶段进行： (1) siRNA形成阶段； (2) RNA诱导缄默复合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)形成阶段 ； (3) 效应阶段 ； (4) 扩增阶段。 rna干扰完整解析第

5、7页RNAi机制外源病毒转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解RNA RdRP合成RNA激活siRNA复合物双链siRNA异常ssRNARdRP合成RNA二级siRNArna干扰完整解析第8页 当前，RNAi作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内说明。生物体因为RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(inverted repeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。 当各种原因产生dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性核酸内切酶Dicer等共同参加。Rde-1,4编码蛋白识别并

6、引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为2125nt大小小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)。 (1) siRNA形成阶段rna干扰完整解析第9页核酸内切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性 rna干扰完整解析第10页siRNAslong dsRNADicer contains two RNAse III domainsrna干扰完整解析第11页 Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其它类似功效酶发挥作用。现认为2125nt大小在3端带有23个碱基悬端和5端磷酸化

7、siRNA诱导RNAi效应最强。 rna干扰完整解析第12页19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNAs have a defined structurerna干扰完整解析第13页 siRNA含有低分子质量、低浓度、缄默信号可在细胞间传递甚至传输至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bpdsRNA可引发机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)激活而使其被降解，从而大大降低了其对mRNA抑制作用。 在RNAi启始过程中发挥酶切作用Dicer酶属于RNase核糖核酸酶家族中第三个家族，该家族RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功效是特

8、异地将dsRNA降解成siRNA，所以，Dicer酶被认为是开启RNAi效应关键。然而，令人费解是，为何Dicer酶降解产物是21nt23ntsiRNA呢?最近对RNase催化结构域结构研究使其真相大白。 rna干扰完整解析第14页 Dicer 一个核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA ： 它属于RNase 家族,含有两个催化结构域、一个解旋酶( helicase) 结构域和一个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域, Dicer 在催化过程中以二聚体形式出现, 其催化结构域在dsRNA 上反平行排列, 形成四个活性位点, 但只有两侧两个位点有内切核酸酶活

9、性, 这两个位点在相距约22bp 距离切断dsRNA , 各种生物体内Dicer结构略有不一样, 致使siRNA 长度存在微小差异。rna干扰完整解析第15页Dicerrna干扰完整解析第16页Models for Dicer cleavagerna干扰完整解析第17页启始阶段加工酶加工成21-23核苷酸片段rna干扰完整解析第18页DicerRISCrna干扰完整解析第19页mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解rna干扰完整解析第20页 siRNA形成siRNADicerRISCrna干扰完整解析第21页(2)RNA诱导缄默复合物形成阶段 生成siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MU

10、T-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-induced silencing complex），含有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源靶mRNA。 rna干扰完整解析第22页RNA诱导缄默复合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)rna干扰完整解析第23页(3)效应阶段 siRNA引导RISC与同源性mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源

11、mRNA与siRNA正义链交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成双链区5起始端下游710个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表示效果。 rna干扰完整解析第24页效应阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶核酸外切酶同源性检索活性核酸内切酶rna干扰完整解析第25页RISC 在这些机制中，RISC是一个很灵活平台，在不一样情况下结合不一样调整分子从而含有不一样功效。RISC复合物关键负责接收从Dicer加工来小RNA，并用该小RNA作为识别其同源底物向导从而介导RNAi发生。rna干扰完整解析第26页RISCRNA-induced Silencing Complex解旋酶核酸内切

12、酶Argonaute proteinsiRNAmRNA250KD (inactive)100KD (active)ATP9/4/2022rna干扰完整解析第27页(4)扩增阶段 该反应以siRNA中一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。 RdRP不但能增加siRNA拷贝数，而且能将异常单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个主要“感应器”，它能识别正常和异常RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP识别下开启R

13、NAi反应过程。 rna干扰完整解析第28页RNAi扩充效应rna干扰完整解析第29页 当前，对这些现象解释最少有四种机制： Dicer酶将长dsRNA分子切成短“初级siRNA”，再由后者降解同源mRNA，故dsRNA长度决定了放大效应水平； siRNA在酶作用中，可屡次利用，能深入提供放大信号； 移行RNAi (transitive RNAi)中，siRNA可作为靶mRNA引物，在RdRP和Dicer等作用下产生“次级siRNA”，造成缄默信号扩增。 “异常RNA”(aberrant RNA)无需引物，可在RdRP作用下生成dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。 以上四种机制中，尤

14、其是移行RNAi发觉为说明缄默效应扩增及传递提供了主要线索。 rna干扰完整解析第30页移行RNAi 移行RNAi是指缄默信号沿特定基因移动。即缄默信号沿特定mRNA由3 5方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成siRNA并非直接来自导入dsRNA，而是在细胞中RdRP作用下，以初级siRNA反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随即在Dicer酶及ATP作用下产生新siRNA，称为次级siRNA。除RdRP经过产生次级siRNA参加RNAi信号扩增外，其它与RdRP含有同源序列蛋白类似物也经过相同方式产生次级siRNA参加缄默信号扩增。另外，RNAi扩增效应还可

15、能存在另外两种机制： (1) Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA长度；(2) siRNA在酶作用下能够屡次应用，产生深入放大效应。 rna干扰完整解析第31页应用： RNAi主要经过在转录后 （post-transcriptional）水平阻断基因表示，造成蛋白无法合成，出现“基因缄默”。比如，咱们能够按确定方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因功效。从理论上说，若能关闭致病基因表示则很多疾病将被治愈。动物试验已证实，能够经过RNAi方法使造成血胆固醇升高基因“缄默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面临床试验也正在进行中；这一方法为

16、病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾治疗指了一条新路 。rna干扰完整解析第32页 药品开发RNAi应用领域病毒性疾病治疗基因功效研究241肿瘤治疗3rna干扰完整解析第33页1）基因功效研究 因为RNAi技术能够利用siRNA使目标基因缄默，研究基因功效。同时siRNA表示文库构建方法建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对说明信号转导通路、发觉新药品作用靶点有主要意义。 rna干扰完整解析第34页2）病毒性疾病治疗 RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因表示。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒增殖。利用RNAi

17、技术抑制过分表示癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周淋巴细胞，不影响另一个HIV-1coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其它病毒感染性疾病可行性大大增加。rna干扰完整解析第35页 Randall等证实了针对 HCV(丙型肝炎病毒) RNAsiRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制 HCV RNA降低80倍；将

18、siRNA 转染至已经有HCV感染、复制细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃细胞有抑制作用；siRNA干扰缄默 HCV RNA含有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证实了siRNA特异抑制 HCV RNA复制、阻止相关蛋白表示作用。rna干扰完整解析第36页Fig3.RNAi抗病毒机制rna干扰完整解析第37页3）肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因过分表示，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新伎俩治疗各种恶性肿瘤。(1)RNAi可应用于敲除点突变激活癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因表示，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。rna干扰完整解析第38页4）药品开发。利用RNAi技术来研究药品作用特异性和机制对于加紧药品开发研制速度大有益处，因为基因组研究结果和高通量筛选技术，为更加好更加快发觉药靶和候选药品提供了