利用ITS序列鉴定真菌

1、北方民族大学实验论文题目：利用ITS序列鉴定真菌学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级：082姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉陈波艾克拜尔指导老师：刘建利完成日期：2011年5月18日2011年6月5日分子生物学实验利用ITS序列鉴定真菌第 页共7页利用ITS序列鉴定真李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波（北方民族大学生物科学与工程学院银川750021）摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank

2、比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株（切OFoboZoMyces密）和假丝酵母ST-50菌株（血sp）。关键词：ITS序列酵母菌PCR菌种鉴定1材料与方法1.1试验材料与试剂实验室提供的红色掷孢酵母菌1和白色产香酵母菌。YEPD液体培养基配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g,配成1L溶液，分装100/250ml,121C灭菌15min。裂解液：1L裂解液中需加Tris1.2114g,EDTA8.767g,SDS5g,用1M的NaOH调至8.0,121C灭菌30min备用。醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。70%乙醇：用95%

3、乙醇配制,现配现用。10XTAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g,EDTA29.22g,用HC1调pH至8.0。1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1xTAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备表一实验中使用的主要仪器仪器名称型号产地立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI上海申安医疗器械厂数显恒温水浴锅HH-4国华电器有限公司电泳仪DYY-12北京市六一仪器厂制冰机AF200PSC50RMSA生物安全柜HFsafe1200/C上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D青岛海尔股份有限公司Sigma咼速离心机3K30Germany电子精密天平HR-200上海精

4、科天平酸度计DELTA302上海电子可调电炉101RF-3天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K太仓市实验设备厂紫外分析仪WD-9403C北京市六一仪器厂台式常温咼速离心机Centrifuge5415DGermany微量移液器多型号Germany生化培养箱LRH-250上海一恒科技有限公司基因扩增仪Palm-CyelerAustralia电泳槽DYCZ-24A北京六一仪器厂1.3实验方法1.3.1酵母菌的活化及培养采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌4，先将菌株接于斜面中，25C培养24h,再转接入三角瓶中100ml/250ml,25C培养24h,保存于4C冰

5、箱备用习。1.3.2酵母菌基因组DNA的提取DNA的提取按照Makimura等6(1994)的方法进行。用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min,弃上清；加入250卩1裂解液；100C水浴15min；加入250卩12.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h；在4C下13000rpm离心5min,上清夜移至一新1.5ml离心管内；加入500卩1的氯仿-异戊醇(24：1),剧烈振荡，13000rpm，离心15min,移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内；重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内；加入50

6、0卩1的冷的异丙醇，放置在-20C静置15min；13000rpm离心15min；用1ml70%的乙醇洗涤沉淀；用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀；将沉淀置于室温下干燥；加入50卩1已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h；(放于-20C冷藏备用；1.3.3酵母菌基因组DNA的检测制备琼脂糖凝胶：将10XTAE贮存液用蒸馏水稀释成1XTAE电泳缓冲液，待用，按1%称取适量琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加入对应量1XTAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。胶板的制备：将制胶槽置于水平支持

7、物上，选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60C的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1XTAE电泳缓冲液得电泳槽内。加样：取20glDNA样品与2gl6x加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5gl的100bpDNAladder。电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm(约100V)电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示

8、分子生物学实验利用ITS序列鉴定真菌第 页共7页出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相（本实验中仪器损坏，直接用相机拍照）。1.3.4ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测1.341PCR反应体系见下表，于冰浴下进行8。试剂浓度PCR缓冲液（包含TaqDNA聚合酶、Mg2+和dNTP）2.5x10正向引物10卩M0.2反向引物10卩M0.2模板DNA10ng/pl-1pg/pl1.0ddH2O13.6表二核糖体基因反应体系的组成（25卩1体系）体积（卩1）1.3.4.2根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩。表三核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件扩增片段引物（53）PCR扩

9、增反应条件ITS1区ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG95C5min；(94C45s,52C1min,ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC72C30s)x30；72C8min。1.3.4.3PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。ITS片段的测序将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。BLAST比对、鉴定属、种登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotideBLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到resultofBLAST。2结果与分析2.1基因组

10、DNA电泳图图一酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图-asaratrp事IDOOOtrp+SQOObp+5Dcnbp-iSCMbp如上图所示，标号“1”为红色掷抱酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；C为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark,共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6类DNA片段。酵母菌的基因组DNA破损片段较小，从图中可以看到，红色掷抱酵母DNA片段小

11、于5000bp,集中于3000bp以下；而白色产香酵母的DNA片段有大于15000bp的，集中区段为5000到1500bp。ITS1片段大小为500bp左右，故这样大小的DNA片段可以满足PCR要求。2.2PCR产物电泳图图二酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图二l1122CM1500bpIDDDbp9DDbpSOObp7D0bp6DDbp500bp4Q0bp如上图所示，标号T”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为红色掷抱酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；“C”为对照组，物任何条带；标号“M”为Mark，共有1500、1000、900、8

12、00、700、600、500、400、300、200、100bp等11类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8类DNA片段。从图中可以看到，白色产香酵母菌和红色掷抱酵母菌的ITS1片段PCR产物大小均位于500-600bp之间，与预测结果相符，目的条带前端存在干扰小条带，可能为引物二聚体所致。2.3菌株序列与鉴定结果2.3.1红色酵母菌鉴定结果红色酵母菌ITS1序列：共594bp。1tttccgtaggtgaacctgcggaaggateattagtgaatetaggacgttcaatttaacttgaagtcc

13、gaac71tetcactttctaaccctgtgcatttgttttggttagtaggattegtetgaacacctetteatttacaaac141acaaagtetatgaatgtataaagtttataacaaaacaaaaetttcaacaacggatetettggctetcgca211tcgatgaagaacgcagcgaaatgtgataagtaatgtgaattgcagaatteagtgaateatcgaatetttg281aacgcatettgcacteettggtattccgaggagtatgtetgtttgagtgteatgaattettcaaccctet351ct

14、tttcttagtgattggagcggagtttggattetgagtgttgctcctaacccgagcteattegtaatgta421ttagcatccatatttgagtttcggattgacttggcgtaataagactattegetgaggaatetaacttegg491ttagaagccgtgtttgaactaggaagctaetaatetagettaagtctacttttagattagaceteaaate561agataggattacccgctgaaettaaagcatatea与Genbank比对结果QuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySb

15、jcttjuerySbjctQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjet1GAATCTAGGACGTTC/kTTTAACTTGA/kGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATliiIliiliiIIIHiliillliiiiIHiIiiillIlil35GAAJCTAGGACGTTCAATTTAACTTGAAGTCCGAACTCTCACTTCTAACC匚TG丁G匚盘1”.61TGTTrrGGTAGTAGGATTCGTCI，GAACACCrrCTTCATTTACAAACACGTCIATGMIIIililllNIlliil

16、iiIIIiiliiililiilIiHi95TGTTTTGGTAGTAGGATTCGTTGMCACCTeTTCxUTTACkUCxCAMGWTATGAA11T.GTATAAAGTTTATAACAAA?lCAAAACT.rrCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAIIII155.TGTATAMGTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGA181215GICJGGTTTGAGrGTCA1IIIIIIITC11rGAC：GCA；lliiiilCT1IGCACllilifCCTIiIGGlIITC1TGAACGCACT1GC

17、ACIreelPIGGTTGAAGAACGCAGCGAATGTGATAGTATGIIIliiilllliiiiI：IiiliiiTGAGA/kCGCAGCGAA/kTGTGATAAGTAATG241275ATTCCGAGGAGTA1iliillhlilllATTOCGAGGAGrATGrCTGTrGAGrGTCATG301MTTCTTCAACCCTCTCTTTTCTTAGT!CATTG(3AGCGGAGTTTGGATTCTGAGTGTT.GCTiiIIliillIIIilIIliilii.IIiiiIill.ii335mttcttcaaccctctcttttcttaggattggagcggag

18、tttggattctgagtgttgct60941201541802142402743003343603944204544S0514361CC1AACCCGAGCTCATTCG：7TAGCA1-ccaiATTTGAG1T1TCGGA7TGA0TTGGIillllllilIIliH1iiiillil1Iiilili11II395CC1AACCCGAGC1TATTCG1KTTAGCA1TCAlTGAG1T1TCGGATTGACTTGG421CGTA/TA/kGACTATTCGCTGAGGAATCTA/kCTTCGGTTAGA/lGCCGTGTTTGAACTAGGAIiiiliiiiiHiHliii

19、IiiililiiiiiiliIliiilili455CGTAATAAGACTAiTCGCTGAGGAAT匚TAACT匚GGTJ盘GAAG匚匚GTG1TTGAACTAGGA481xGCTACTMCTAGCrTMGTCACTTTACAr-rACACC-TCmTCAGAlWGCAT-rACCC540illiiiiIilliilIiiiiiiliUIliiIlllillliiii515AGCTACTAACTAGCTTAAGTCTACTTTTAGArTAGACCTCAAjTCAGATAGGATTACCC-574541GCTGAACTTaAAGCATATCA560IIIIIilllllIII57&.GG

20、TGMCTTaMGCATATCA594鉴定结果红色掷抱酵母属于Sporobolomycessp,TY-241菌株。其分类学地位如下:Eukaryota;Fungi;Dikarya;Baidiomycota;Pucciniomycotina;Agaricostilbomycetes;Agaricostilbomycetesincertaesedis;mitosporicAgaricostilbomycetidae;Sporobolomyces.真核生物；真菌界；双核亚界；担子菌门；柄锈菌亚门；冬抱菌纲；黑粉菌目；掷抱酵母科；掷抱酵母属。2.3.2白色酵母菌鉴定结果白色酵母菌ITS1序列：共551

21、bp。1aaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaaaagcteaaatttgaaagccteggeatt71gtaatttcaaggcggcagaccacaccgaccacaagtccattggaacatggcgccacagagggtgacagcc141ccgtaggtegcagcgcgtgtettccgccaaagagtegagttgtttgggaatgcagctetaacggtggtaa211attccateaaaagctaaataccggcgagagaccgatagegaacaagtaeagtgatggaaagatgaaaagc281aettt

22、gaaaagagagtgaaacagtaegtgaaattgttggaagggaagggtttgggagcagacacggtteg351gccgggccageatcaattaegcgcgcgccacaaaacgcccgagaacgtaagccgteteggtggttatage421tcggcgccatagcgcgcgcgtgattgaggacagcatatteaggatgetggegtaatgettccaaaccgcc491egtettgaaacacggaccaaggagtetaacgtccatgeaagtgtttgggtgcaaaacccca与Genbank比对结果QuerySbjctQue

23、rySbjctQuerySb.ictQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjct6.MUCAACAGGGArTGCCTCAGTMCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAAGIllillllllllIIIIIIlllllllillllllllllllllIlliHilliamcCaacagggattgcctcagtmcggcgagtgaagcggcaaaagcTcaaatttgaaag66CCTCGGCATTGTMTTTCAAGGCGGCAGACCACACCGACCACGTC

24、CATTGGAACATGGIIHillIIIllllllllllllllllllllllllllllIIIllllllII61U.CTtGCATTGTMTTTCAAGGCGGCAGACCACACGGACCACMGTCCATTGGAACATGG12.6:CGCCACAGAGGGTGACAGCCC0GTAGGTCGCAGCGCGTG7CTTCCGCCjkAAGAGTCGAC，llll：lllllllllllllllllIIIlllllllilIIlllllllllllIlli121CGCCACAGAGGGTGACAGCCC0GTAGGTCGCAGCGCGTG7CTTCCGCC.MGAGTCGAG1

25、8611TGGGAA1HillGCAGCIHill1“AAOGHillrGGlIIAAATIIITCCAlIIICAaAAGCIlllllllAAAlIIIACCGGCG/iGAGlllllllllll1S11G7GGGAA1GCAGC1ClAACGG1rcGirw.TTCCAqVAaAAGCIAAAACCGGCGAGAG245ACCGATAGCGMCJAGTACAGTGATGGAAAATGAAAAGCACT11GAA.AGAGAGTGMAHIPllllllllllIlliIIlllllllllllllillllllllllllIlli241ACCGATAGCGMCAAGTACAGTGATGG

26、AAAGATGAAMGCACTTTGAA.ViGAGAGTGmFO6CAGTACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAGGGnTGGGAGCAGACACGGTTCGGCCGGGOCAGIIIMlIlliIllllllllllllllllllllllllllllllllllllll301CAGTACGTGAAATTGTTGGMGGGAAGGGT7TGGGAGCAGACACGGTTCGGCCGGG0CAG36S：CATCUTTACGCGCGCGCCACJ.CGCCCGAGMCGTAAGCCGTCTCfJGTGGTTATAGCIIIIIlllllllllllllllllllllllllllllHl

27、lllIIIIIIIIII3&1CAlCAAirACGCGCGCGCCAUAAAACGCCCGAGMCGTAAGCCGTCTCGGTGGlrAlAGC426TCGGCGCCATAGCGCGCGCGTGTTGAGGACAGCATATTCAGGATGCTGGCGTAATGCllllllllllllllllIIllllllllllIMillIIIlliIIII拒1tcggcgccatagcgcgcgcgtgttgaggacagcatattaggatgctggcgtaatgc48&犯1546541CCAAACCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACGTCCATGCGTGTT

28、TGGGTiiimiiiiiiIllllllllIIIIIIIlliIINIIIIHillIIIICCAAACCGCCCGTCTTGW.CACGGACCAAGGAGTCTAACGTCCATGCUGTGTTTGGGTGCAAAACCCCAGCAAAACCCCA556551656社1251.20185ISO24524030530036536d醴54204854SO545540.鉴定结果白色产香酵母菌属于Candidasp,ST-50菌株。其分类学地位如下：Eukaryota;Fungi;Dikarya;Ascomycota;Saccharomycotina;Saccharomycetes;Sacc

29、haromycetales;mitosporicSaccharomycetales;Candida.真核生物；真菌界；双核亚界；子囊菌门；酵母亚门；酵母纲；酵母目；隐球酵母科;假丝酵母属。图四Candidasp,ST-50图三Sporobolomycessp,TY-241分子生物学实验利用ITS序列鉴定真菌第7页共 页3讨论酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果由图一可知，所提取出来的基因组DNA片段比较小，只有5000bp以下，与酵母菌单染色体大小107bp相差较大。具体原因可能如下：在DNA提取步骤中，加完裂解液后要100C水浴10min，时间可能过长，是DNA断裂较为厉害；在用氯仿异戊醇抽提蛋白质时，要剧烈摇动10min,这样的步骤