云南白药对自发性高血压大鼠肾脏炎症状态的改善作用

1、云南白药对自发性高血压大鼠肾脏炎病症态的改善作用【摘要】目的观察云南白药(YNBY)对自发性高血压大鼠(SHR)肾脏炎病症态的影响，讨论其对高血压肾脏疾病的防治作用及机制。方法将6周龄SHR分为YNBY治疗组和高血压模型对照组，在3个时间点(给药6周，给药14周，停药后9周)研究YNBY对SHR血压值、肾脏炎性因子表达和氧化应激程度的影响。结果YNBY对SHR无明显降压作用(P0.05)。YNBY在RNA和蛋白程度抑制了细胞间粘附分子-1(IA-1)和内皮型一氧化氮合酶(eNS)在SHR肾脏的高表达(P0.05)。YNBY在给药14周和停药9周时降低了过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)的R

2、NA表达(P0.05)，在给药14周时明显降低了PPAR的蛋白表达(P0.05)。YNBY给药后显著降低了SHR肾脏组织蛋白羰基化程度(P0.05)，在给药14周及停药9周后均可显著进步SHR肾脏总抗氧化才能(P0.05)。结论YNBY给药后可以显著减轻SHR肾脏炎症反响和氧化应激程度，YNBY可能在防治高血压肾病方面具有一定的疗效。【关键词】云南白药;自发性高血压大鼠;高血压肾脏疾病;炎症反响Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsfYunNanBaiYa(YNBY)ninflaatrystatusfthekidneyfrspntaneuslyhyperten

3、siverats(SHR),andtexplrepreventiveandtherapeutiusagefYNBYnhypertensivenephrpathy.ethds6eeksldSHReredividedintSHRntrlgrupandSHR-YNBYgrup.TheeffetsfYNBYnsystlibldpressure,expressinfinflaatin-relatedfatrsandlevelfxidativestresseredeterinedat3tiepints:6eeksfYNBYtreatent;14eeksfYNBYtreatent;and9eekspst-Y

4、NBYtreatent.ResultsYNBYdidntaffettheelevatinfbldpressurefSHR(P0.05).Hever,theTpundinhibitedtheexpressinfinterellularadhesinleule-1(IA-1)andendthelialnitrixidesynthase(eNS)atbthRNAandprtEinlevels(P0.05).Atthetiepintsf14eeksftreatentand9eekspst-treatent,HPsignifiantlyattenuatedperxiseprliferatr-ativat

5、edreeptr(PPAR)RNAexpressin(P0.05).TheprtEInlevelfPPARasalsinhibitedbyYNBYarkedlyafter14eeksftreatent(P0.05).YNBYsignifiantlyreduedprteinarbnylntentsfSHRkidney(P0.05).Inadditin,after14eeksftreatent,YNBYinreasedttalanti-xidantapaityfrenaltissuefrSHR(P0.05)andthiselevatedanti-xidantapaityasevenaintaine

6、dfr9eeksaftertreatent(P0.05).nlusinYNBYanreduetheinflaatrystatusandxidativestressfSHRkidney,hihayserveasthebasefrtheadvanedtherapeutiutilityfYNBYinhypertensiverenaldisease.Keyrds：YunNanBaiYa(YNBY);Spntaneuslyhypertensiverat(SHR);Hypertensivenephrpathy;Inflaatin肾脏是高血压的重要靶器官之一。最近研究说明，炎症反响不仅参与了高血压疾病的发生

7、开展，更是与高血压心、脑、肾等多个靶器官损害亲密相关1。炎症反响不仅可导致肾脏纤维化和肾单位的损伤，同时也参与了肾小球滤过膜的破坏，因此抗炎相关治疗已经成为防治高血压肾脏疾病新的重要环节。云南白药(YNBY)由云南民间医生曲焕章于1902年研制成功，具有活血消肿、止血止痛的成效，临床上可有效应用于多种出血性疾病的治疗2。近年来随着中医药学现代化研究的深化，YNBY的临床应用也在不断地得到拓展。本研究将观察YNBY对SHR肾脏炎病症态的影响，进一步明确其作用环节和机理，为开拓其在防治高血压肾脏疾病方面的临床应用提供科学根据。1材料与仪器1.2试剂与仪器Trizl试剂购自美国Siga-Aldih公

8、司;RT-PR试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术;引物合成自上海生工生物工程技术;抗体购自美国SantaruzBitehnlgyIn公司。PR扩增仪：德国Bietra公司;GIS凝胶图像分析系统：上海天能科技;无创尾动脉血压测定分析系统：上海奥尔科特生物科技;酶标仪Spetraax190：美国leularDevies公司;分光光度计UV-1700：日本Shiadzu公司。其它试剂为国产分析纯。2方法2.1动物分组及给药将48只SHR随机分为YNBY组和高血压模型组，每组24只，以24只同周龄的KY大鼠为正常对照。将YNBY溶于蒸馏水中灌胃给药，药物浓度为20g/l，日用药量为200g/kg,S

9、HR模型组和KY对照组大鼠每日按10l/kg灌胃蒸馏水。分别在给药6周、给药14周和停药9周后分3批处理动物。2.2检测指标2.2.1血压测定采用无创测量大鼠血压的装置进展尾动脉收缩压测定。测定前将大鼠置于35恒温箱中预热10in，然后测量大鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压46次，取其平均值。每周定时进展测定一次。2.2.2动物处理及肾脏组织总RNA、蛋白提取大鼠腹腔注射40g/kg戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼处死，取出肾脏组织液氮速冻后-80保存，用于总RNA、蛋白样品制备。取大鼠冻存肾脏组织50100g，加1lTrizl试剂，按照试剂使用说明提取总RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8

10、2.0之间。取大鼠肾脏组织约200g，在2l中含有蛋白酶抑制剂的PBS(pH7.4)中匀浆组织，4离心15in两次，取上清即为总蛋白样本。2.2.3逆转录聚合酶链式反响(RT-PR)按照RT试剂盒说明书进展DNA的合成，PR扩增所需引物序列及反响条件如表1所示，-atin作为内参照。扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，以上海天能图像分析系统对所得条带光密度进展扫描分析。表1PR反响所需引物序列及条件2.2.4蛋白质印迹(estern-blt)分析用Lry法测定蛋白浓度后，按照每孔50g蛋白样品上样。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)别离总蛋白，电转移蛋白至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温下封闭1h，参

11、加一抗IA-1(1200)、iNS(1400)、-atin(11000)4过夜。PBS-T洗膜35in后，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(15000)室温孵育1h，化学发光法进展显色反响，最后在暗室中显影定影。2.2.5肾脏组织总抗氧化才能测定采用高铁复原抗氧化才能(FRAP)测定法。5l肾脏组织蛋白样品和245lFRAP工作液在37反响10in后，分别以PBS和水溶性维生素-E(Trlx)作为空白和标准对照，于593n处测定吸光度值。2.2.6肾脏组织蛋白羰基化程度测定采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)法测定肾脏组织蛋白羰基化程度。蛋白质被氧化后形成的羰基可与DNPH反响生成红棕色

12、的沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后于370n处读取吸光度值,从而测定蛋白质的羰基含量。羰基浓度以摩尔消光系数22.0l/(L)计算，羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nl的羰基来表示。2.3统计分析所有数据以s表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进展单因素方差分析。3结果3.1YNBY对SHR血压值的影响结果见表2。模型组SHR收缩压较正常对照KY大鼠明显升高(P0.05)。给药YNBY6周，14周及停药9周后，SHR的收缩压与模型组大鼠比拟无明显差异(P0.05)。表2YNBY对SHR血压值的影响与KY组比拟，P0.05;与SHR模型组比拟，P0.05;n=83.2YNBY对S

13、HR肾脏IA-1和eNS表达的影响见图1(a)、1(b)、1()，模型组大鼠肾脏eNS和IA-1的RNA表达显著高于正常组(P0.05)，YNBY治疗后(给药6周，给药14周，停药9周)可显著降低SHR肾脏eNS和IA-1的RNA表达程度(P0.05)。如图2(a)、2(b)、2()所示，与KY大鼠比拟，模型组SHR肾脏可见eNS和IA-1蛋白的高表达(P0.05)。在各处理批次(给药6周，给药14周，停药9周)YNBY均可以显著降低eNS和IA-1的表达程度(P0.05)。3.3YNBY对SHR肾脏PPAR表达的影响如图1(a)、1(d)所示，模型组大鼠肾脏PPARRNA表达显著高于正常组(

14、P0.05)。YNBY给药6周后对PPAR的表达无明显影响(P0.05)，在给药14周和停药9周后可明显降低其RNA程度(P0.05)。如图2(a)、2(d)所示，与KY大鼠比拟，在各处理周龄模型组大鼠PPAR的蛋白表达均有明显进步(P0.05)。YNBY在给药6周及停药9周后对PPAR的蛋白表达无明显影响(P0.05)，而在给药14周时可以显著抑制PPAR的高表达(P0.05)。3.4YNBY对SHR肾脏总抗氧化才能的影响见表3。模型组SHR在20，29周龄时肾脏总抗氧化才能相对于KY大鼠明显降低(P0.05)。YNBY给药6周后，SHR总抗氧化才能与模型组大鼠比拟有进步趋势(P0.05)，

15、在给药14周和停药9周时SHR肾脏总抗氧化才能明显进步(P0.05)。表3YNBY对SHR肾脏总抗氧化才能的影响3.5YNBY对SHR肾脏蛋白羰基化程度的影响见表4。与KY组比拟，SHR模型组肾脏蛋白羰基化程度显著进步(P0.05)。YNBY给药后，SHR蛋白羰基化程度与SHR模型组大鼠比拟明显降低(P0.05)。表4YNBY对SHR肾脏蛋白羰基化程度的影响与KY组比拟，P0.05;与SHR模型组比拟，P0.05;n=84讨论肾脏是高血压的重要靶器官之一,高血压肾病可导致很高的高血压病致死、致残率。目前关于高血压肾脏损伤的发病机理有许多学说和解释，国际最新研究说明发生于肾脏的慢性炎症反响是高血

16、压肾脏损伤的重要病变因素。成年SHR肾脏纤维化、蛋白尿和肌酐去除率降低明显，同时伴随着肾脏炎症因子的高表达和氧化应激的发生3，4。YNBY自从20世纪初行销于世以来，誉满中外，历久不衰，被誉为伤科圣药。我们研究中心首次对YNBY的心血管系统现代药理学作用进展了创新性审视，认为YNBY可能在抑制炎症反响、保护血管内皮、降低氧化应激方面具有一定作用，而有关YNBY在此方面的应用却未见报道。本研究将通过观察YNBY对SHR肾脏炎病症态的影响，探究其对高血压时肾脏损害的保护作用及机理。转贴于论文联盟.ll.动脉压增高是高血压时肾脏发生病变的重要诱因。然而研究说明，在血压未升高的幼龄SHR肾间质中便存在

17、着单核/巨噬细胞的浸润和NADPH氧化酶的活化，这说明炎症反响和氧化应激可能不依赖于血压值的增高而引发肾脏损伤5。在保护高血压靶器官损伤、降低高血压各种临床终点事件中，降压也并非是唯一重要的疗法，这可以从HP及他汀类药物可以独立于血压值之外减轻高血压并发症中得到证明6，7。肾脏炎症反响发生时，肾小管上皮细胞IA-1和血管细胞粘附分子-1(VA-1)表达增加，二者可能介导了白细胞从小管周围毛细血管内皮细胞到肾脏间质的迁移8。成年SHR肾小球细胞和血管内皮细胞IA-1蛋白表达明显进步，大量单核细胞浸润肾小球，24h尿蛋白量增多，并且核转录因子-B(NF-B)的活化与IA-1的表达及单核细胞浸润、尿

18、蛋白量均呈明显正相关9，提示原发性高血压时活化的NF-B可通过上调肾组织IA-1基因表达，促进单核细胞浸润肾组织从而引发肾脏损害。生理条件下由eNS产生的N在调节血管张力、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞(VS)增殖方面起了重要作用。然而在多种病理状况下往往伴随着eNS脱偶联的现象，此时eNS不再产生N而是产生大量的氧自由基，而且过氧化氢可以刺激eNS在血管壁的代偿性增高10，11。实验结果说明SHR肾脏eNS较KY明显进步，提示SHR肾脏eNS脱偶联病理现象的存在。YNBY可以显著降低SHR肾脏eNS的表达程度，说明YNBY可通过干预eNS脱偶联的现象而起到肾脏的保护作用。同时

19、在本研究中，YNBY在RNA和蛋白程度降低了SHR肾脏IA-1的表达，提示YNBY对发生于SHR肾脏的慢性低度炎症反响具有显著的抑制作用。PPAR具有抗炎和抗氧化作用。在Fisher344大鼠肾脏中PPAR通过抑制p65核易位和NF-B的结合活性，从而降低了诱导型一氧化氮合酶(iNS)、环氧合酶-2(X-2)、IL-1、IL-6和VA-1的表达12。在原代培养的血管内皮细胞中PPAR可同时上调铜锌超氧化物歧化酶(uZn-SD)的表达和下调复原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚单位phx22的表达13。然而，在肾脏纤维化实验动物模型中PPAR却呈高表达，而且罗格列酮降低了PPAR的

20、表达程度14，15。与此相似本研究发现PPAR在SHR肾脏组织中高表达，这可能是机体对炎症及氧化损害所发生的一种代偿性反响，推测YNBY对炎症反响和氧化应激的抑制可能是下调PPAR表达的作用机理。同时在本研究中YNBY治疗后对PPAR的RNA和蛋白表达虽有降低作用，但没有出现同步变化。考虑到PPAR的转录活性不仅与其RNA及蛋白表达程度有关，还与PPAR翻译后修饰如泛素化和N-末端磷酸化、抑制剂调节等多种因素亲密关联16，YNBY对PPAR活性的详细影响及机制尚有待进一步研究。炎症发生时多伴随氧化应激程度的增高。活性氧(RS)可通过直接氧化修饰蛋白质、脂质、糖类和DNA造成组织损伤;RS还可上

21、调NF-B的活性和转化生长因子-(TGF-)的表达，进而引发部分的炎症反响和纤维化过程17，18;RS可通过负向调节L-Arg的转运19，氧化失活BH420，氧化eNS的锌指构造造成eNS脱偶联10，因此RS被认为是导致eNS脱偶联和内皮功能损伤的核心机制。含氮自由基过氧化硝酸盐(N-)还可与uZn-SD分子构造域中的u发生反响，在SD分子上将酪氨酸残基硝基化，SD自身硝基化后其去除RS的才能会显著降低21。研究说明在转基因Ren-2大鼠肾脏中，NADPH氧化酶的活化和RS的过量产生造成了足细胞足突消失和微动脉纤维化等肾脏损害22。总抗氧化才能可以反映机体的氧自由基代谢状况总抗氧化才能降低说明

22、机体氧自由基去除缺乏，生成相对过量，而蛋白羰基化含量可用来衡量蛋白质氧化损伤的程度。YNBY组分中的麝香、重楼、三七均具有显著的抗氧化作用。本研究发现YNBY给药后明显进步了SHR肾脏组织的总抗氧化才能，同时降低了蛋白质氧化损伤程度，提示YNBY可通过抗氧化应激作用保护高血压肾脏损伤。总之，本研究证明YNBY对SHR血压值无明显影响，然而可以通过抑制SHR肾脏炎性因子的表达，减轻氧化应激改善高血压时发生于肾脏的炎症反响，提示HP在高血压肾脏疾病的防治方面具有一定的应用潜能。关于YNBY对SHR肾脏纤维化、硬化及肾小球滤过膜包括血管内皮细胞、基膜和足细胞裂孔形态学的影响尚需进一步研究和观察。【参

23、考文献】1Savia,ShiffrinEL.InflaatininhypertensinJ.urrpinNephrlHypertens,2022,15(2):152.2孔令春，厉夏女，彭卫珍.云南白药的临床应用J.中国药业，2022，16(14)：63.3SunL,GaYH,TianDK,etal.InflaatinfdifferenttissuesinspntaneuslyhypertensiveratsJ.AtaPhysilgiaSinia,2022,58(4):318.4刘淑华，张黎军，刘昌慧，等.氯沙坦对TGF-1在自发性高血压大鼠肾小管表达的影响及作用J.中国临床药理学与治疗学，20

24、22，10(2)：145.5BisasSK,FariaJB.hihesfirst:renalinflaatinrxidativestressinspntaneuslyhypertensiveratsJ.FreeRadiRes,2022,41(2):216.6武多娇，洪华山，江琼.麝香保心丸减轻自发性高血压大鼠心肌纤维化的研究J.中国中西医结合杂志，2022，25(4)：350.7heng,ZhuSH,Zhang,etal.TheeffetfAtrvastatinnprtEinuriaandplasaRPandIL-6inpatientsithhypertensivenephrpathyJ.hi

25、nJHypertensin,2022,13(4),767.8ertliB,Bek-ShierB,FanX,etal.ehanissfhyalurnan-induedup-regulatinfIA-1andVA-1expressinbyurinekidneytubularepithelialells:hyalurnantriggerselladhesinleuleexpressinthrughaehanisinvlvingativatinfnulearfatr-kappaBandativatingprtEIn-1J.JIunl,1998,161(7):3431.9韩跃刚，黄彦生.雷米普利对自发性

26、高血压大鼠肾脏核因子-B表达的影响J.中国卫生检验杂志，2002，12(4)：426.10StuehrD,PuS,RsenG.xygenredutinbynitrixidesynthasesJ.JBilhe,2001,276(18):14533.11ShaneRT,Kaihen,JhnF,etal.Hydrgenperxideativatesendthelialnitri-xidesynthasethrughrdinatedphsphrylatinanddephsphrylatinviaaphsphinsitide3-Kinase-dependentSignalingPathayJ.JBilh

27、e,2002,277(8):6017.12SungB,ParkS,YuBP,etal.Aeliratinfage-relatedinflaatinandxidativestressbyPPARgaaativatr:suppressinfNF-kappaBby2,4-thiazlidinedineJ.ExpGerntl,2022,41(6):590.13InueI,GtS,atsunagaT,etal.Theligands/ativatrsfrperxiseprliferatr-ativatedreeptralpha(PPARalpha)andPPARgaainreaseu2+,Zn2+-superxidedisutaseanddereasep22phxessageexpressinsinpriaryendthelialellsJ.etablis,2001,50(1):3.14HeYQ,YangP,ZhuJ,etal.TheexpressinfPPARinarabbitdelfatherslersisandtheeffetfTelisartanJ.hinJLabDiagn,2022,11(4):533.15林沁，顾勇，林善锬.罗格列酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质炎症及其纤维化的保护作用J.2022，14(3)：224.16FlydZE,Ste