临床生物化学：第24章 连续监测法测定酶活性浓度

1、第二十四章连续监测法测定酶活性浓度第2页教学目标与要求 掌握色素原底物反应、脱氢酶参与反应和过氧化物酶参与反应的连续监测法测定酶活性的原理与方法；ALP、GGT、AMY、ALT、AST、CK、LD、ChE等酶活性的测定原理及其注意亊项。 熟悉特殊反应类型的连续监测法测定酶活性的原理与方法，四大类连续监测法测定除上述酶外，其它酶活性的测定原理及其注意亊项。 了解上述各酶活性测定方法的历史演变及其优缺点。第3页第3页色素原底物反应的连续监测法脱氢酶参与的连续监测法过氧化物酶反应的连续监测法特殊反应类型的连续监测法主要内容第4页酶活性浓度的测定在临床生化检验中占有重要的地位，约占测定总量的1/4到1

2、/3。测定方法主要有定时法和连续监测法两种。由于定时法难以确定在选定的反应时间内是否处于线性期，反应的时间都较长，检测效率低，因此，临床大多用连续监测法来测定酶活性浓度。第4页第5页第5页色素原底物反应过氧化物酶参与反应脱氢酶参与反应特殊反应连续监测法第6页水解酶类或转移酶类经酶促反应将无颜色的底物转变为有颜色的产物，在一定波长具有吸收峰，通常把这类底物称为色素原底物。特点是水解之前无颜色，水解之后释放的产物有色。这类底物大多有自行慢慢分解的特点，因此要求底物避光保存，检测的初始吸光度不能高于0.5。第一节 色素原底物反应的连续监测法第7页第7页碱性磷酸酶測定一-谷氨酰基转移酶测定二淀粉酶测定

3、三-岩藻糖苷酶测定四五N-乙酰氨基葡萄糖苷酶测定六甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定第8页一、碱性磷酸酶測定（alkaline phosphatase，ALP）布氏法： ALP 作用于-甘油磷酸钠产生磷酸根，定量磷测定酶活性。少用金-阿法：以磷酸苯二钠为底物， 经ALP作用生成酚，定量酚测定活性。少用皮-劳法：以4-硝基酚磷酸钠盐为底物，水解生成对硝基酚，碱性条件下呈黄色，连续监测。第9页第9页在碱性溶液中ALP催化无色的4-NPP分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP)，后者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处连续监测吸光度增高速率，

4、计算ALP活性。（二）IFCC推荐的测定方法第10页第10页IFCC推荐法以4-NPP为底物，AMP为缓冲液。测定结果更可靠，一般不需要做样品空白对照，干扰相对较小。AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）和DEA（二乙醇胺）都是激活型缓冲液，作为底物参与反应，所测的的ALP活性要比用碳酸盐缓冲液高26倍。而DEA的激活作用比AMP更强。因此使用不同缓冲液的方法测的ALP活性参考区间不同。注意饮食、抗凝剂、溶血、温度等的影响。（三）方法学评价第11页以L-谷氨酰-（）-萘胺为底物，生成的（）-萘胺与重氮试剂生成红色化合物。该方法灵敏度低，底物溶解度差，受溶血干扰较大。以L-谷氨酰对硝基苯胺（GN

5、A）为底物，双甘氨酸为谷氨酰基的受体，产物在碱性环境下呈黄色，可以连续监测，有较好的灵敏度和准确性，但底物溶解度差,现已不推荐。以L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺（GCNA）为底物，GGT催化生成的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色。二、-谷氨酰基转移酶测定（-glutamyltransferase, GGT）（一）测定方法概述第12页第12页L-谷氨酰-（）-萘胺为底物方法灵敏度低，底物溶解度差，受溶血干扰较大-L-谷氨酰对硝基苯胺为底物可以连续监测，有较好的灵敏度和准确性，但底物溶解度差L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物IFCC推荐方法（一）测定方法概述第13页第13页以色素原GCNA为

6、底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化-谷氨酰基团从GCNA转移至甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基-5-氨基苯甲酸。后者的生成量与样品中的GGT活性成正比关系，故测定405nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。（二）IFCC推荐的测定方法第14页第14页GCNA第3位上含有亲水基团羧基，溶解度增加，而且底物稳定性好，自身水解作用小，是IFCC的推荐方法。原IFCC推荐方法的测定条件pH为8.20，反应温度30；若反应温度37时最适pH则为7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系；甘氨酰甘氨酸的作用既是缓冲液又可看成是底物，与甘氨酸或甘氨三肽为受体相比，酶促反应速度可以提高5倍。（三）方法学

7、评价第15页第15页2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为7.96103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择401nm或405nm时需注意校正。由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积分数0.0909，为了样品和反应液在37平衡，故需要孵育时间180s和底物启动模式。（三）方法学评价第16页以天然淀粉为底物：样品稀释法、时间滴定法、碘淀粉比色法等。但天然淀粉的分子结构与葡萄糖的组成不确定而难以标准化，测定的准确性和重复性都较差，而且线性范围窄，测定误差大。-葡萄糖苷酶-己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联法是最早使用的连续监测法。以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测

8、定方法，例如对硝基酚麦芽庚苷法，目前最为常用。三、淀粉酶测定(-Amylase, AMS)（一）方法概述第17页第17页以2-氯-对硝基苯酚麦芽三糖苷（ CNP-G3 ）为底物，被淀粉酶水解释放出2-氯-对硝基酚（CNP）。淀粉酶水解CNP-G3的速度是G3的10倍，因而不需要用辅助酶，直接水解产生CNP在405nm有光吸收，该法准确性较好。从理论上说这是一种最理想的测定方法，但易受内源性-葡萄糖苷酶的干扰。尿标本中细菌污染偶尔会干扰反应。（一）方法概述第18页第18页以对硝基酚麦芽庚苷(4-NP-G7）为底物，经AMS催化水解为游离的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的对-硝基苯酚寡糖

9、苷(4-NP-G2、4-NP-G3和4-NP-G4)。后者在-葡萄糖苷酶催化下，进一步水解为葡萄糖和对-硝基酚(其摩尔数仅为酶解底物4-NP-G7的1/3，其余2/3还结合在4-NP-G4中)。对-硝基酚的生成量在一定范围内与-淀粉酶活性成正比。（二）常用方法第19页第19页用半乳糖-2-氯-4-硝基苯酚-麦芽糖做底物，评价基本与CNP-G3一样，而且不受内源性-葡萄糖苷酶的干扰。明显的溶血会使结果偏低，而高浓度的免疫球蛋白（Ig G50g/L）会对结果带来正向干扰。不管用何种方法，脂性血清中脂蛋白会导致AMS结果偏低。另外，临床中还应注意巨淀粉酶血症的存在，输注的羟乙基淀粉或右旋糖酐会导致巨

10、型复合物的产生。（三）方法学评价第20页第20页1.羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲系统中pH升高硝基苯酚的摩尔消光系数也增大。不同的蛋白质体系中摩尔消光系数也有变化。2.-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，若将PNP-G7的非还原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，就可以阻止这种水解作用，稳定性可提高59倍。3.多功能-葡萄糖苷酶对PNP-G7的所有降解产物都有相同的转换率，可以直接用PNP的摩尔吸光系数计算酶活性。（三）方法学评价第21页连续监测法4-硝基酚-L-岩藻吡喃糖苷底物法放免法荧光法（一）方法概述三、-岩藻糖苷酶测定（alpha-L-fucosidase，AFU）第22页AFU作用于2-Chlo

11、ro-4-nitrophenyl- alpha-L- fucopyranoside（CNPF)生成2-氯-4-硝基酚（CNP）和-L-岩藻吡喃糖。405nm波长处吸光度的上升速率与AFU的活性成正比，即可计算出样品中AFU的活性。（二）常用方法第23页第23页CNPF法所采用CNP的解离常数(pKa)5.5与AFU的最适pH相近，缩短了反应时间，无需样本空白，实现了AFU的连续监测法测定。提高pH可提高CNP的离子化率，但过高的pH会影响酶活性；该方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都有所提高。溶血仍有干扰。测定可用血清或适量EDTA-Na2和草酸钠抗凝的血浆，肝素和 柠檬酸盐抗凝剂不可

12、使用。（三）方法学评价第24页第24页PNP-NAG法：CPR-NAG法：固定时间法：对硝基酚葡萄糖苷法MCG-葡萄糖苷法4-甲基伞形酮基乙酰氨基葡萄糖苷荧光法五、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶测定（一）方法概述第25页第25页以2-氯-4- 硝基酚-N-乙酰- beta-D-氨基葡萄糖苷为底物，在NAG催化下水解产生CNP，色素原的pKa为5.5，与NAG酶的最适pH4.6相近，在反应条件下色原呈色不需要加碱性呈色剂，反应进入线性期时通过连续监测405nm处吸光度的变化，用摩尔吸光系数法计算酶活力单位。（二）常用方法第26页第26页CNP的pKa为5.5，与NAG的最适pH一直，且有足够大的摩尔消光

13、系数，可以直接速率法分析，无需样品空白，但底物溶解性差，稳定性不够，非酶水解较明显。pH 7.0时CNP离子化率97%，pH 5.0时只有25%左右，因此吸光度约为PNP法的1/4，而且离子化程度受pH影响较大，建议在临床使用中，实际测定摩尔吸光系数，计算分析仪的K值，提高检测结果的准确性。（三）方法学评价第27页GDPA早期采用甘氨酰-L-脯氨酸-2-萘酰胺作为底物，由于萘酰胺具有致癌作用而少用。现发展了以甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺建立起来的方法有连续监测法、非连续的直接比色法和间接比色法，其中以连续监测法最为方便快捷荧光法：灵敏度较高，可用于尿液中GPDA的测定。六、甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测

14、定（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）（一）方法概述第28页第28页GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在405nm波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。（二）常用方法第29页第29页连续监测法具有简便快速，重复性好，线性范围宽，敏感性高，结果准确等优点。底物稳定易溶，检测试剂为液体双试剂，没有非酶水解现象，使用非常方便。试剂需放28储存，避免冷冻、污染，否则将导致失效。GPDA检测的最适pH为8.6，有研究认为在pH7.98.9之间，随反应液pH的升高，底物的自然水解显著

15、加快，试剂空白速率明显增加。（三）方法学评价第30页第30页检测340nm吸光度变化速率，反映了NAD(P)H的生成或消耗速度，从而可直接测定氧化还原酶；也可利用酶偶联反应，间接测定以氧化还原酶做指示反应的酶活性。NADPH或NADH不稳定，在含有NADPH或NADH的试剂中，由于配制或保存的原因使他们会被氧化，吸光度降低，因此在使用时要求初始吸光度不能低于0.9。第二节 脱氢酶参与的连续监测法第31页第31页丙氨酸氨基转移酶测定一门冬氨酸氨基转移酶测定二肌酸激酶测定三肌酸激酶同工酶测定四五乳酸脱氢酶测定第32页第32页ALT测定丙酮酸赖氏法偶联丙酮酸氧化酶法IFCC推荐法测定谷氨酸酶电极法一

16、、丙氨酸氨基转移酶测定（alanine aminotransferase, ALT）（一）方法概述第33页第33页该法属于酶偶联法，LD为指示酶，连续监测NADH在340nm的吸光度下降速度来计算酶活性。该法也是我国检验学会的推荐方法。（二）常用方法第34页IFCC推荐方法将测定温度30修改为37，将-酮戊二酸的用量从2mmol/L提高到15mmol/L，基本满足了最大反应速度对-酮戊二酸的用量要求，扩大了测定范围，提高了测定准确性。特别规定：LD应用兔肌来源的干粉制剂，不能选用硫酸铵悬浮液；可加入清蛋白和叠氮钠来保持其活性；但酶制剂和清蛋白中应没有GLDH和ALT的污染。（三）方法学评价第3

17、5页第35页缺点：内源性丙酮酸和GLDH的干扰，采用双试剂底物启动模式可以消除部分干扰，延长延滞期也可以消除部分干扰，要求用高纯度的试剂和无氨蒸馏水。IFCC推荐法建议试剂中添加5磷酸砒哆醛，这与我国推荐方法不同。5磷酸砒哆醛可使脱辅基的酶恢复酶活性，对肿瘤化疗病人和肾病病人（有一部分脱辅基的酶）来说，与不含有辅酶的试剂相比测得结果有明显差别。（三）方法学评价第36页第36页AST的检测方法和ALT基本相同，有赖氏法和连续监测法。IFCC推荐的连续监测法用苹果酸脱氢酶（MD）做指示酶。赖氏法简便易行，不需要特殊设备，曾被广泛使用。但是草酰乙酸对AST有反馈抑制作用，使结果偏低，不能实现自动化分

18、析。二、门冬氨酸氨基转移酶测定(asparate aminotransferase, AST)（一）方法概述第37页第37页（二）IFCC推荐方法 该方法也是属于酶偶联法，以MD做指示酶，连续监测NADH在340nm的吸光度下降速度来计算酶活性。该法是我国检验学会的推荐方法。第38页第38页IFCC推荐法用苹果酸脱氢酶做指示酶，由于产物草酰乙酸不稳定，易转变为丙酮酸，故试剂中加入LD，实质是两个指示酶，但通常将LD做为辅助酶。该法预孵育期较长，达90s，目的是在预孵育期将内源性的丙酮酸转化为乳酸，减少内源性丙酮酸的干扰。（三）方法学评价第39页第39页化学发光法荧光法比色法连续监测法肌酸激酶测

19、定(creatinine kinase, CK)三、肌酸激酶测定(creatinine kinase, CK)（一）方法概述第40页第40页以n-乙酰半胱氨酸（NAC）做激活剂，偶联HK，以G6PD做指示酶，连续监测NADPH在340nm的吸光度上升速度来计算酶活性。该法也是我国检验学会的推荐方法。(二）IFCC推荐方法第41页第41页酶偶联连续监测法：反应速度快，不需做血清空白，在临床广泛使用。1.巯基激活物 CK是巯基酶，常用NAC、谷胱甘肽和巯基乙醇做激活剂，但应注意试剂纯度。同时用乙二胺四乙酸络合二价钙离子，防止NAC由于二价离子催化发生的氧化，从而增加反应混合物的稳定性。（三）方法学

20、评价第42页第42页2.腺苷酸激酶(AK)的干扰和消除 红细胞含有大量adenylate kinase使CK活性假性增高。测定时常AP5A和AMP两种AK抑制剂联合使用。3延滞期 25C 110s、30C 90s和37C 60s。4线性 测定线性最低可达3000U/L，高于此值时用150mmol/L的氯化钠溶液稀释后再测定。由于血清中的抑制物也被稀释，稀释后的测定结果比原结果偏高。（三）方法学评价第43页第43页电泳法：该方法准确性、精密度和灵敏度都较差，且费时，操作繁琐，电泳的高温也会使CK活性下降。免疫抑制法：试剂中含有抗CK-M亚基的抗体，使CK-MM 100%被抑制，CK-MB则有50

21、%被抑制，若不考虑CK-BB的含量，抑制后的酶活性乘2就是原来CK-MB的酶活性。离子交换层析法：操作比较繁琐，临床应用较少。四、肌酸激酶同工酶测定（一）方法概述第44页肌酸激酶同工酶测定离子交换层析法电泳法免疫抑制法（一）方法概述第45页第45页免疫抑制和酶动力学结合具有快速、准确和特异的优点。免疫抑制法是基于血清中CK-BB的量很低，如果CK-BB的量很高会带来巨大的误差。巨CK不含有CK-M亚单位，不发生免疫抑制，如同CK-MB而错误地被测定，以致测得活性超过样本中总CK活性。CK-MB质量的测定分析灵敏度高，真实的反应血清中CK-MB的量，目前普遍采用，也是AMI诊疗指南推荐的方法。（

22、三）方法学评价第46页第46页连续监测法：以正向反应（LP）应用较为广泛，是IFCC和我国检验学会的推荐方法。比色法：用2,4-二硝基苯肼显色测定丙酮酸生成量或以吩嗪甲酯硫酸盐或心肌黄酶为电子传递体，使四唑蓝还原成蓝色染料后比色测定NADH生成量。荧光法：灵敏度高，需特殊仪器，在临床常规中应用少五、乳酸脱氢酶测定(lactate dedhydrogenase, LD)（一）方法概述第47页第47页正向反应（LP ）连续监测法是IFCC和我国检验学会的推荐方法，有酶有证参考物质。 1.（L-P）2.（P-L）：（二）常用方法第48页第48页正向反应优点：乳酸和NAD很稳定，NAD含抑制LD的杂质

23、少，乳酸对LD的抑制作用小，线性范围较宽。缺点：需高底物浓度，反应速度较慢。逆向反应优点：NADH用量少，试剂成本低，反应速率快，灵敏度高缺点：丙酮酸和NADH的稳定性差；过量丙酮酸对LD的抑制作用大。NADH种类、纯度和来源对酶反应速度有明显的影响。（三）方法学评价第49页第49页氨羧基甲酸是LD的竞争性抑制剂，草酸盐是非竞争性抑制剂，高浓度的尿素能使LD分子解聚或破坏酶蛋白二级或三级结构，使酶完全失活，低浓度的尿素是LD的竞争性抑制剂。（三）方法学评价第50页第50页第三节 过氧化物酶反应的连续监测法过氧化物酶（peroxidase , POD）是以过氧化物为电子受体催化底物氧化的酶，被测

24、物质通过酶作用产生的H2O2，在4-AAP和POD的存在下，可生成红色醌亚胺化合物，也叫Trinder反应。优点是可在可见光范围内比色，可以连续监测，易于自动化，因此具有比较重要的使用价值。Trinder反应的过氧化物酶对底物专一性差，维生素C、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质对反应有干扰。第51页第51页 脂肪酶测定一 5-核苷酸酶测定二 腺苷脱氨酶测定三第52页测定LPS的实际质量双抗体夹心免疫分析法、乳胶凝集法测定底物的减少量如比浊法、扩散法等测定产物（游离脂肪酸）的增加如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等一、脂肪酶 测定（一）方法概述第53页第53页检测波长550nm（

25、二）常用方法第54页第54页酶偶联显色比色法特异性高，双试剂能消除内源性甘油的干扰问题，但高浓度的胆红素会使结果偏低10%15%。甘油三酯和胆固醇（包括HDL-C和LDL-C）测定试剂盒成分中均含有脂肪酶，检测中可能存在交叉污染。由于原理、试剂和测定方法不同，各种方法的结果相差很大。在使用校准品时一定选择相应方法的相应值。（三）方法学评价第55页二、5-核苷酸酶测定(5-nucleotidase, 5-NT)磷比色法测定生成氨的量Kalckar氏连续监测法5-NT偶联PNP、XOD、过氧化氢酶和醛脱氢酶偶联腺苷酶和谷氨酸脱氢酶连续监测法（一）方法概述第56页第56页检测波长510nm（二）常用

26、方法第57页第57页借助过氧化氢酶的缩合反应，检测产物上升的速率的方法克服了血清空白高的问题，但试剂成本高。该方法易受血清中氧化还原性物质如维生素C的干扰， 如果试剂中加入抗坏血酸氧化酶即可消除这种干扰。高浓度胆红素和溶血会干扰测定。由于红细胞内含有较大量的5-核苷酸酶，因此溶血会使测定结果偏高。（三）方法学评价第58页三、腺苷脱氨酶测定（Adenosine deaminase, ADA）Kaplan法Kalckar氏法奈氏显色法、PAGE活性染色法、波氏比色法、氨气敏电极法、ADA偶联GLDH反应PNP法（一）方法概述第59页第59页检测波长550nm（二）常用方法第60页第60页反应抗干扰

27、能力强，适合自动化快速测定。但该法准确度不够高，因为嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）和黄嘌呤氧化酶（XTO）溶液中含有的硫酸氨可造成ADA活性下降，使测定值偏高。该方法易受血清中氧化还原性物质如维生素C的干扰，如果试剂中加入抗坏血酸氧化酶即可消除这种干扰。高浓度胆红素和溶血的干扰也应该注意。（三）方法学评价第61页第61页第四节 特殊反应类型的连续监测法定时法是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色化合物。也有个别酶不终止反应，直接加入与酶促反应无关的试剂，与酶促反应的某一产物反应生成有特征性的化合物来实现连续监测。表面上看类似人工合成底物，但实际上是利用某些特殊反应实现连续监测。第62页第62页 胆碱酯酶测定一 酸性磷酸酶测定二第63页Add TitleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleClick to edit title styleC