2015年起-克隆产品齐学会系列1

1、姓名：齐学会日期：2016年7月克隆与点突变系列产品2上篇：克隆基础原理下篇：克隆与点突变系列产品与竞品比较培训内容3上篇：克隆基础原理什么是克隆什么是基因克隆基因克隆构建流程基因克隆技术分类及原理4克隆克隆，是Clone 的译音，意为无性繁殖。 英语Clone一词起源于希腊文Klone，原意是用嫩枝或插条繁殖。 现在克隆的含义已不仅仅是简单的无性繁殖，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫克隆。这种来自一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫无性繁殖系，简称无性系。在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、马铃薯、玫瑰等插枝繁殖的植物。而动物的克隆技术，则经历了由胚胎细胞到体细胞的发展

2、过程。5克隆6基因克隆基因克隆技术（Gene Cloning Techniques）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 基因克隆（clone）是指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程。7基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。这项革命性的研究技术，可概括为分、切、连、转、选。 “分”分离制备合格的待操作的DNA，包括载体DNA和目的DNA；“切”用序列特异的限制性内切酶切开载体DN

3、A和目的DNA；“连”用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接，形成重组DNA分子；“转”将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。 传统的酶切连接基因克隆的发展8获取目的基因选择合适载体体外重组导入宿主细胞重组子筛选鉴定基因组文库cDNA文库人工合成PCR扩增质粒噬菌体其他病毒感受态细胞法细菌载体上的遗传标志菌落PCR酶切测序基因克隆的过程概述目的基因启动子复制原点终止子标记基因9过程一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法：用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛

4、选目的基因。分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，反转录得到cDNA，构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。人工体外合成基因：仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。10过程二、选择合适载体前述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，且一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。基因工程的载体应具有一些基本的性质：在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力分子量尽可能小载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗

5、传标记（如抗药性标记基因） 载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点11DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid）噬菌体载体（phage）柯斯质载体（cosimid）单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ）噬粒载体（phagemid）酵母人工染色体（YAC）载体的分类（根据载体的使用目的）：克隆载体表达载体测序载体穿梭载体过程二、选择合适载体12过程三、体外重组体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体或重组子。目的基因TOPO克隆Gateway酶切连接同源重组TA克隆13过程四、导入宿主细胞载体DNA分子

6、上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。14过程五、重组子筛选鉴定阳性重组体的筛选：可利用载体上的遗传标志，包括抗药性(采用无抗药性的受体菌)、氨基酸合成酸系(用缺该酶系的异养型受体菌)和颜色反应(如互补效应)等。菌落杂交，将平皿上的转化菌落转印到硝酸纤维膜上，经碱处理使DNA变性，然后用目的基因的标记探针与之杂交，漂洗去多余的探针后进行放射性自显影，根据显影片上的斑点可判断含有目的基因的菌落。15重组DNA的鉴定：菌落PCR、限制性酶切图谱、DNA测序，Southern印迹杂交等，

7、可根据情况酌情使用。过程五、重组子筛选鉴定16获取目的基因选择合适载体体外重组导入宿主细胞重组子筛选鉴定克隆流程再回顾17基因克隆质粒水平基因构建的载体蛋白分子生物学中的基本克隆技术用于表达或其他的定向克隆用于测序或其他的入门克隆用于修饰或其他的定点突变技术成熟，但是费时，费力；连接效率低，阳性率低；克隆位点易受限制。18定向克隆定向克隆同源重组传统克隆酶切连接不依赖连接酶依赖连接酶19酶切连接消化载体 + 消化插入片段 = 连接PS:克隆位点不友好或缺少时，克隆难度再次加大！基因构建的载体蛋白限制性内切酶技术成熟，但是费时，费力；连接效率低，阳性率低；克隆位点易受限制。20酶切连接21案例

8、1: 较少的可用酶切位点酶切连接22案例 2: 单一的可用酶切位点高背景CIAP 酶双向性酶切连接23案例 3: 无可用酶切位点酶切连接24多个基因多个构建质粒多个蛋白同一载体案例 4: 多个基因 + 同一载体酶切连接25ClonExpress让克隆随心所欲！基于同源重组的无缝克隆技术不依赖连接酶Exnase+ Exnase如果可识别，然后可重组。末端可识别26+ Exnase同一原理: 定向克隆 + 入门克隆 + 定点突变基于同源重组的无缝克隆技术不依赖连接酶Exnase末端可识别如果可识别，然后可重组。ClonExpress让克隆随心所欲！27ClonExpress II引物设计PCR扩增

9、插入片段线性化载体重组反应30 min转化 仅需3.5小时Vazyme的ClonExpress IIClontech的In-Fusion专利酶10ul重组体系，15min 50含酶切位点在内的15bp同源臂28Clontech的In-Fusion29Clontech的In-Fusion引物设计：5突出平端3突出30全式金的Uni Cloning31全式金的Uni Cloning引物设计：5突出平端3突出32NEB的Gibson Assembly33NEB的Gibson Assembly34NEB的NEBuilder HiFi DNA Assembly35入门克隆：将靶基因插入到特定的载体，用于

10、测序或其他。TA CloningTOPO Blunt/TA CloningGateWay CloningPCR - (+dA尾) - 纯化 - 连接高保真度的PCR & +dA尾，效率很低长片段克隆，效率很低载体自连，高背景费时入门克隆36TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的 3 端自动添加一个 3-A 突出端。利用 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。 原理如下： TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩

11、增产物上加接头，即可直接进行克隆。TA CloningTA Cloning37全式金的TOPO Blunt/TA Cloning偶联拓朴异构酶平末端带A的粘性末端PCR产物末端平端载体T载体PCR产物平端载体PCR产物T载体38Invitrogen的GateWay Cloning基因重组：Homologous bination(同源重组)Site-specific bination(位点专一性重组)位点专一性重组：在专一酶作用下，在DNA特定位点上发生断裂和 重接，从而产生精确的DNA重排的DNA重组方式。特点：1.要专一识别位点，交换的为短同源片段 2.需要专一酶的识别，结合； 3.参与该过

12、程的酶的表达被细胞调节过程引发。39位点专一性重组机制独立的环形分子结构整合到宿主基因组中又称原噬菌体两种类型间的转换即整合和切离，都是通过噬菌体 DNA和细菌DNA之间的位点专一性重组实现的特定位点叫做附着点(attachment site，att)Invitrogen的GateWay Cloning40GateWay重组机制Invitrogen的GateWay Cloning41引物设计PCR扩增插入片段重组反应30 min转化 仅需3.5小时ClonExpress EntryVazyme的ClonExpress Entry42获取目的基因选择合适载体体外重组导入宿主细胞重组子筛选鉴定克隆流程再回顾高保真酶Gelred高保真酶GelredC112/C113C114T4连接酶PCR酶Gelred感受态43用于功能研究的基础方法 扩增分离转化定点突变44Quick Change扩增DpnI 消化转化非指数模板量大退火定点突变45如果使用 Mut ExpressPhanta Max Exnase扩增DpnI 消化转化Vazyme的Mut Express46小结什么是克隆构建无性繁殖系什么是基因克隆构建单一的DNA重组体的无性繁殖系47获取目的基因选择