分子荧光分光光度法实验技术

1、分子荧光分光光度法实验技术2022/9/3第1页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一分子发光分析法分子发光分析包括: 荧光分析（fluorescence analysis） 磷光分析（phosphorescence analysis） 化学发光分析（chemiluminescence analysis） 该类分析方法与吸收分光光度法有密切关系。2022/9/3第2页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一分子发光分析法 若分子吸收了光能而被激发支较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光，荧光分析和磷光分析是基于这类光致发光

2、现象而建交起来的分析方法。 2022/9/3第3页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一分子发光分析法 该类分析方法与吸收分光光度法有密切关系。 当物质分子吸收辐射能而被激发到较高电子能态之后，在返回基态的过程中，要释放出部分能量。2022/9/3第4页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一一、荧光分析法 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。若物质分子用X射线或红外光激发，则分别产生X射线荧光或外光荧光。2022/9/3第5页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一一、荧光分析法 通

3、常所指的分子荧光是指紫外-可见光荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后，发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光分析。2022/9/3第6页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一二、荧光分析法的应用 荧光分析可应用于物质的定性检测及定量分析。由于物质结构不同，所能吸收的紫外光波长不同，在返回基态时，所发射的荧光波长也不同，利用这个性质可以鉴别物质。对于同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可进行定量分析。2022/9/3第7页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一二、荧光

4、分析法的应用 荧光法主要应用在医学检验、生物医学、药物、环境监测、食品分析等方面，尤其对体内活性物质及药物代谢物的测定更为重要。2022/9/3第8页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一三、荧光分析法的特点 荧光法的主要特点： 1）灵敏度高，检出限为10-7-10-9g/ml，比紫外可见分光光度法高101000倍。 2）荧光法的选择性强，能吸收光的物质并不一定能产生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长，产生的荧光强度也不同。 3）它还有用样量少、操作简便等的优点。 荧光法的缺点是，由于许多物质不发射荧光，因此使它的应用范围受到限制。2022/9/3第9页，共52页，2

5、022年，5月20日，10点6分，星期一四、荧光法的基本原理 1）激发光谱和荧光光谱2）激发光谱和荧光光谱的的形状及其关系3）物质的分子结构和荧光的关系4）环境对荧光的影响 2022/9/3第10页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一1）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即发射光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。它们是荧光分析中定性和定量的基础。 荧光物质的最大激发波长（ex）和最大荧光波长（em）是鉴别物质的根据，也是定量测定时的最灵敏的条件。2022/9/3第11页，共52页，20

6、22年，5月20日，10点6分，星期一1）激发光谱和荧光光谱激发光谱 ： 如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长的激发光的照射下，荧光最强处荧光强度的变化，以激发波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。 2022/9/3第12页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一1）激发光谱和荧光光谱荧光光谱 ：固定激发光波长和强度，而让物质发射的荧光通过单色器分光，以测定不同波长的荧光强度。以荧光波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作 图，便可得到荧光物质的荧光光谱。 2022/9/3第13页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星

7、期一 2）激发光谱和荧光光谱的的形状及其关系 荧光物质的激发光谱和荧光光谱形状相似。这是因为物质分子吸收了一定波长的紫外光后，才能发射出荧光。吸收越多，发射的荧光强度也越强。 一般把激发光谱看作是荧光物质的表观吸收光谱。激发光谱和荧光光谱呈现大致的镜像对称关系。 2022/9/3第14页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3）物质的分子结构和荧光的关系 了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质或将荧光强度不大或选择性不高的物质转化为荧光强度大及选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。2022/9/3第15页，共52页，2022年，5月20日，

8、10点6分，星期一3）物质的分子结构和荧光的关系 物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小紧密相关。 分子产生荧光必须具备2个条件： （1）物质分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构 （2）物质分子吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率大，在相同的浓度下，荧光的发射强度也大。 2022/9/3第16页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3）物质的分子结构和荧光的关系1、具有共轭双键体系的分子。共轭程度越大，分子的荧光效率越大。 2、具有刚性平面结构的分子。刚性的不饱和的平面结构具有较高的荧光效率，分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高。 3、苯环上取

9、代基的类型。给电子基团常使荧光增强，吸电子基团及卤素会减弱甚至破坏荧光。 2022/9/3第17页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一4）环境对荧光的影响 分子所处的环境，如温度、溶剂、PH值等都会影响分子结构和立体构像，从而影响荧光强度 。 （1）温度：一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加；相反，温度升高荧光效率将下降 。 （2）溶剂：同一种荧光物质溶于不同的溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显的不同。一般情况下，随着溶剂的极性增加，荧光强度将增强。 2022/9/3第18页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一4）环境对

10、荧光的影响（ 3）溶剂PH值的影响，当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶剂PH值对荧光强度有较大影响。（4）猝灭剂的影响，荧光猝灭是指荧光物质与溶剂子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈线性的关系的现象。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂（quencher）。常见的猝灭剂有卤素离子、重金属离子、氧分子、以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。2022/9/3第19页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一五、荧光分光光度计的结构发光源：采用高压氙灯。试样池：荧光分析用的试样池需用低荧光材料，常用石英池，形状为四面透光的方形。检测器：荧光的强度比较弱，因此要求检测

11、器有较高的灵敏度，常用光电倍增管。单色器：采用光栅作为单色器。2022/9/3第20页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一六、荧光的定量分析 1、荧光测定的线性范围一般在10-5100g/ml。当浓度较高时，吸光度（A）0.05时，由于自猝灭和自吸收等原因，荧光强度与浓度不呈线性关系，荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离，发生负偏差。2、与紫外-可见分光光度法相同，也可采用标准曲线法和标准对照法。2022/9/3第21页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一六、荧光的定量分析 3、测量条件的选择 选择线性范围：当荧光物质溶液的吸光度A0.05时，荧光强度与浓

12、度才呈线性关系。 选择合适的激发光和荧光波长：一般选择激发光谱中能产生最强荧光的入射光波长作为激发光，荧光光谱选择最强荧光的波长作为荧光测定的波长。2022/9/3第22页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一七、荧光分光度计的性能可检测荧光、磷光及生物发光扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采集速率达80次/秒波长范围：190-1100 nm光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档切换具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。2022/9/3第23页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一八、荧光分光度计的使用 1、开启计算机，键入用户名和密码，打

13、开分光光度计主机，运行Cary Eclipse软件。2、按样品的测定要求进入相应的测定模块。3、设定测定参数，按操作流程测试样品，测定结果保存或打印。4、测试完毕后，在系统指定的出口退出系统；先关闭分光光度计主机电源，再关闭电脑，切断总电源。5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登记本上填写使用记录。2022/9/3第24页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一操作软件包2022/9/3第25页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一定性分析操作2022/9/3第26页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一预扫描2022/9/3第27页，共52

14、页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第28页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一移除谱图2022/9/3第29页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一定性扫描参数设置2022/9/3第30页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一设置错误2022/9/3第31页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第32页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第33页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第34页，共52页，2022年，5月2

15、0日，10点6分，星期一2022/9/3第35页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一谱图存贮2022/9/3第36页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一图谱格式-FBSW2022/9/3第37页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一数据格式-CSV2022/9/3第38页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一定量分析操作2022/9/3第39页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第40页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一参数设置2022/9/3第41页，共52页，2022年

16、，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第42页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一标准样品设置2022/9/3第43页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一待测样品设置2022/9/3第44页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一空白校零2022/9/3第45页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一开始测定2022/9/3第46页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第47页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第48页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一重新计算2022/9/3第49页，共52页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2022/9/3第5