Tricine系统检测低分子量蛋白酶抑制剂的电泳方法研究

1、Tricine体系检测低分子量卵白酶按捺剂的电泳要领研究廖海周嘉裕高冬梅黄丹娥靳晓娥李利平【摘要】目的创立一种可以或许检测差异分子巨细尤其是低分子量卵白酶按捺剂的电泳要领。要领根据特异卵白酶按捺剂按捺靶卵白酶活性的原理，借助明胶-Triine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分散样品，胶板经卵白酶水解后，以考马斯亮蓝染色。结果小分子量的胃卵白酶按捺剂与较大分子量的BBI均能在该要领中表现出活性带，而且利用该要领检测到山合欢种子中含有一种胰卵白酶按捺剂。结论该要领可以或许满意差异分子大孝差异范例卵白酶按捺剂检测的必要。山合欢胰卵白酶按捺剂的创造对山合欢进一步的研究和综合开拓有紧张意义。【关键词】山合欢

2、Triine体系卵白酶按捺电泳Abstrat：bjetiveTestablishandetetingethdfrprteaseinhibitrs,espeiallyfrl-leular-Eightinhibitrs.ethdsInhibitrsaplesereseparatednagelatin-SDSinaTris-Triinebuffersyste.Aftereletrphresis,thegelasinubatediththetargetprteasesthydrlyzethebakgrundgelatin.Theinhibitrbands,hihereundigestedbytheta

3、rgetprteases,erestained.ResultsL-leular-eightinhibitr(pepstatinA)andlargerinhibitr(sybeanBan-Birkinhibitr)eredenstratedbythisethdandshedlearblueinhibitrbandsinthehitebakgrund.Bythisethd,atrypsininhibitrasdetetedfrtheseedsfAlbizziakalkra(Rxb.)Prain.nlusinThisethdntnlyfitfrinhibitrsithdifferentleulara

4、ss,butfitsfrinhibitrsithvariusspeies.rever,thetrypsininhibitrfundinAlbizziakalkraisiprtantfrfurtherresearhandverallexplratin.Keyrds：Albizziakalkra(Rxb.)Prain；Triinebuffersyste；Prteaseinhibitr;Eletrphresis卵白酶按捺剂是一类可以按捺靶卵白酶水解活性的成果多肽，到场体内很多紧张生理历程的调治，普及存在于豆科、禾本科及葫芦科等植物的种子及块茎中1。别的,动物的血液、精液、胰脏中以及酵母菌、链霉菌属等

5、微生物中亦有卵白酶按捺剂的存在2。卵白酶按捺剂具有抗炎抗熏染的本领，已被普及用于治疗急性胰腺炎，烧伤后休克及产后大出血等疾病3。更紧张的是很多临床前研究创造卵白酶按捺剂具有落糖、抗辐射、按捺因不良情况因素引起的癌转化历程、按捺肿瘤细胞生长的作用，有大概开拓出新型的治疗糖尿并抗癌药物46。因此探求及利用卵白酶按捺剂是极具研究意义的。由于卵白酶按捺剂属于小分子多肽，有些卵白酶按捺剂的分子量乃至小于1000，为了能从质料中探求新的卵白酶按捺剂，创立得当于低分子量卵白酶按捺剂的检测要领非常需要。我们接纳Triine体系，在分散胶中参加明胶，电泳分散样品后，胶板以特定卵白酶水解，末了用考马斯亮蓝染色的要

6、领，创立了一种满意差异分子量大孝差异范例的卵白酶按捺剂检测必要的电泳要领。1仪器与质料TU-1901紫外分光光度计(北京普析)；iniPrteinIII垂直板电泳槽美国BiBrad公司；山合欢Albizziakalkra(Rxb.)Prain的成熟种子采自西南交通大学峨眉校区；Arylaide、Bisarylaide、胰卵白酶、甘氨酸、Tris、Triine、胃卵白酶按捺剂(PepstatinA，分子量为685Da)为Ares.产物；胃卵白酶、大豆Ban-Birk卵白酶按捺剂(BBI，分子量为8800Da)为Siga产物；别的试剂均为国产阐发纯。2要领与结果2.1山合欢卵白酶按捺剂粗提物制备按

7、Genv等7的要领略加修改。山合欢种子(20g)打磨成粉，参加200l去离子水，室温搅拌提取2h，离心(6000g，20in,4)，沉淀再用100l去离子水抽提1次，离心(6000g，20in，4)，归并2次上清液。加固体硫酸铵至35%饱和度，4静置留宿，离心(6000g，20in，4)网络上清液。上清液参加固体硫酸铵至55%饱和度，4安排2h，离心(6000g，20in，4)，网络沉淀，用少量去离子水溶解，对去离子水充实透析，离心(10000g，10in，4)，所得上清液即为山合欢卵白酶按捺剂粗提物，置-20下储存。2.2合欢卵白酶按捺剂粗提物按捺活力的测定卵白质浓度的测定接纳Bradfrd

8、法8，以牛血明净卵白为尺度卵白。按捺活力根据Erlanger等人的要领9，以实行条件下，与不加按捺剂的样品的汲取值比力，每低落0.1个A410n的汲取值为一个按捺活性单元。实行结果：由20g山合欢种子可以制备得到14l粗提物，用Bradfrd法测定卵白质含量为0.5gl-1，测定对胰卵白酶的按捺活力为202单元/g卵白。实行结果表白山合欢粗提物中含有胰卵白酶按捺剂。2.3明胶-SDS明胶-SDS接纳Hanspal等10的要领略加修改，分散胶浓度12%(pH8.8)，分散胶中含有0.2%(/V)明胶。样品处置惩罚液配方：6%SDS，300Tris-Hl，pH8.0，50%甘油，0.05%溴酚蓝。

9、样品与样品处置惩罚液按21比例混淆。电极缓冲液为25Tris，250甘氨酸(pH8.3)，0.1%SDS。电泳完毕后，胶板经去离子水冲洗3次，置于2.5%TritnX-100溶液中复性25in两次。用去离子水冲洗胶板屡次，将含有BBI和山合欢粗提物的电泳胶条置于胰卵白酶酶解缓冲液中，另将含有PepstatinA的电泳胶条置于胃卵白酶酶解缓冲液中，37水浴保温30in，再用考马斯亮蓝R-250染色40in，10%乙酸-10%乙醇脱色留宿。胰卵白酶酶解缓冲液配方为100Tris-Hl，pH8.0缓冲液(内含50g/l胰卵白酶)。胃卵白酶酶解缓冲液配方为0.2%Nal，Hl，pH3.0缓冲液(内含5

10、0g/l胃卵白酶)。结果见图1。2.4明胶-Triine-SDS接纳Shagger等人创立的Triine体系11并略加修改，分散胶为12%(/V)丙烯酰胺，0.32%(/V)双丙烯酰胺，0.2%(/V)明胶，10%(/V)甘油，0.75Tris-Hl，pH8.45，0.1%SDS。浓缩胶为5%(/V)丙烯酰胺，0.13%(/V)双丙烯酰胺，0.33Tris-HlpH6.8。样品处置惩罚液配方及样品的处置惩罚与明胶-SDS要领雷同。电泳时，以0.2Tris(pH8.9)缓冲液为阳极缓冲液，以0.1Tris，0.1Triine，0.1%SDS(pH8.25)缓冲液为阴极缓冲液，电流巨细为1A/孔，

11、当溴酚蓝迁徙至凝胶底部时制止电泳。电泳完毕后，胶条的处置惩罚历程与明胶-SDS雷同。结果见图2。3讨论明胶-SDS是根据Laeli体系而创立的检测卵白酶按捺剂的常用电泳要领10。该要领得当于检测较高分子量的卵白酶按捺剂，如BBI在明胶-SDS中能不雅察到清楚的按捺活性带(图1a)。然而在传统Laeli体系中，小分子短肽的浓缩是较困难的，由于小分子短肽与SDS形成的复合体具有与SDS自己雷同的电荷和巨细，会出现短肽-SDS复合物与SDS颗粒共迁徙的征象，导致分子量小于1kDa的短肽无法获得较好的分散结果11，12。如图1中，含有PepstatinA的电泳胶条未创造有按捺活性带的出现。Shagge

12、r等11报道了一种革新的Laeli法,用Tris-Triine体系取代Tris-glyine体系后可很好地分散分子量在1100kD的卵白质。该要领低落了分散胶的pH值(pH8.45)，使卵白质的挪动速率变慢，进步了电泳区分率；其次，接纳不一连的电极缓冲体系和利用Triine交换甘氨酸作为慢迁徙离子，排除短肽-SDS复合物与SDS颗粒的共迁徙效应，改进小分子量短肽的电泳结果11。我们起首观察该要领的敏捷度，结果创造500ng的BBI在明胶-Triine-SDS中能不雅察到清楚的按捺活性带(图2a)，其电泳迁徙率要低于明胶-SDS，表白该要领具有很高的敏捷度。更为紧张的是PepstatinA在明胶

13、-Triine-SDS中可以或许不雅察到一条清楚的按捺活性带(图2)。以上结果表白该要领的长处在于敏捷度高，可以或许检测差异范例、差异分子巨细的卵白酶按捺剂，补充了明胶-SDS无法检测低分子量卵白酶按捺剂的缺陷，从而为大量样品的挑选事情提供了有用、快捷的技能本领。山合欢Albizziakalkra属豆科怕羞草亚科乔木。比年来创造山合欢皮具有平静安神、抗烦闷等成果13,14，是一种极具开拓代价的药用植物。但一旦山合欢皮被利用后，会破坏树木，粉碎生态情况。山合欢种子一样平常在秋日结果后作为废物任其天然消散，未充实加以利用。因此，在应用山合欢皮时，应同时开拓山合欢种子，一可充实利用天然资源，二可庇护

14、情况。我们别离利用明胶-SDS和明胶-Triine-SDS检测了山合欢粗提物，结果均创造只有一条按捺活性带(图1b，图2b)，说明山合欢种子只含有一种胰卵白酶按捺剂。迄今未见国表里有关山合欢胰卵白酶按捺剂的报道。因此，本实行结果对山合欢进一步的研究和综合开拓具有紧张意义。对此我们将进一步分散纯化这种胰卵白酶按捺剂，并举行按捺肿瘤细胞实行。【参考文献】1LaskskiJr,QasiA.hatanthestruturesfenzye-inhibitrplexestellusabutthestruturesfenzyesubstrateplexesJ.BihiBiphysAta,2000,1477:

15、324.2王竞，康庄，廖海，等.白菜型油菜种子胰卵白酶按捺剂纯化及部门性子研究J.天然产物研究与开拓，2022，17(3):275.3贾洪，张宁.胰卵白酶按捺剂研究希望J.中华医学理论杂志,2022,2(10):126.4LippanS,atrisianL.PrteaseinhibitrsinralaringenesisandhepreventinJ.linialanerresearh,2000,6:4599.5itshiH,EsirituI.Develpentftbaske-induedlungtursiniefedBan-Birkprteaseinhibitrnentrate(BBI)J.

16、anerLett,2002,183:141.6郭瑞华，王宁静，刘正猛，等.永川豆豉胰卵白酶按捺剂的分散纯化及其落糖活性研究J.时珍国医国药,2022,18(2)：291.7GenvN,GshevI,NiklvaD,etal.AnveltherstableinhibitrftrypsinandsubtilisinfrtheseedsfBrassianigra:ainaidsequene,inhibitryandspetrspiprpertiesandtherstabilityJ.BihiBiphysAta,1997,1341:157.8Bradfrd.Arapidandsensitiveethd

17、frquantitatinfirgraquantitiesfprtEinutilizingthepriniplefprtein-dye-bindingJ.AnalBihe,1976,72:248.9ErlangerBE,KkskyN,hen.ThepreparatinandprpertiesftnehrgenisubstratesftrypsinJ.ArhBiheBiphys,1961,95:271.10HanspalJS,BushellGR,GhshP.Detetinfprteaseinhibitrsusingsubstrate-ntainingsdiuddeylsulfate-plyarylaidegeleletrphresisJ.AnalBihe,1983,132:288.11ShaggerH,JagV.Triine-sdiuddeylsulfa