实验一 叶绿体的分离与荧光观察

1、实验一叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的：通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。二实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以 及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的 颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的 颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞 组分。叶绿体的分离应在等身溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/

2、L蔗糖溶液)中 进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心 2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min 的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最 好在0 C5C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如 温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外， 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。三、实验用品：1、材料：新鲜菠菜2、试剂：（1）0.35mol/L氯化钠溶液（2）0.01%吖

3、啶橙（acridine orange）3、器材：（1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。（2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等。1、叶绿体的分离与观察：（1选取新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干后去除叶梗脉称30g于150ml 0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆23分钟。（3）将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。（4）取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。（5）将上清液在3000r/min下离

4、心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混 有部分细胞核）。（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。（7）取上述叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光 显微镜下观察:在普通光镜下观察;在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光; 在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光，取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察。2、菠菜叶手切片观察：用剃须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1-2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察。（1）在普通光镜下观察。（2）在荧光显微镜下观察其直接荧光。（3）观察其间接荧光：向所制手切片上滴加1-2滴0.01%吖啶橙染液，染色1 分钟，洗去余液，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。瓦实验结果：1、叶绿体的分离和观察：（1）在普通光镜下，叶绿体呈现绿色的长椭圆形。（2）在荧光显微镜下，当用绿光照射时，叶绿体发出红色荧光；而用蓝光照射时，同样发出红色荧光，相对绿光照射时的较暗。而用吖啶橙染色后，叶绿体发出红色荧光，而混杂在其中的细胞核细胞核发出绿 色荧光。2、菠菜叶手切片观察：1）在普通光镜下可以看到3种细胞：（1