细胞核的制备实验原理及步骤

1、实验3 细胞核的制备、鉴定原理为研究细胞核及其组成成分，如：染色质、DNA及核内小分子RNA等，需分离制备细胞核。对于所分离的细胞核，要求保持形态上的完整性，核内成分不渗漏，不污染细胞质等其他细胞器，并且能有较高的得率。根据实验的需要可以选择不同的分离细胞核的方法，通常用来分离细胞核的方法主要有二大类：第一大类有机溶剂的方法，经Allfrey改进的方法，主要包括如下操作过程：（1）将组织冷冻干燥；（2）研碎细胞；（3）利用不同比重有机溶剂使细胞核与细胞质其他成分分开。这类方法可以防止细胞核内水溶性的成分丢失，同时也能阻止细胞质的某些成分渗入细胞核内。虽然有这些优点，但这种方法不能保持细胞核的正

2、常形态，某些酶活力可能因变性而丧失。所以一般采用非水溶剂分离细胞核，常用于定量分析细胞核的生化成分及其他一些特殊的研究目的。第二大类，1956年由Chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的比重较大，在高密度介质中，在高速离心条件下被沉降下来，从而达到细胞核与细胞质其他成分分开的目的。Chauveau的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/L蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀在底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作好可分离得到细胞核。其后又有不少研究工作者对此方法作了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等，改变分离介质的渗透压；

3、选择介质的pH以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的pH，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但是实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，另外此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显蓍地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液pH，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子量的核酸，可能是由于核糖核酸酶（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸络合所致。柠檬酸的浓度对分离

4、细胞核的质量有较大影响。通常在较低的pH时，可以得到较高纯度的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞核内核酸，一般常在pH4，甚至在pH2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核内的酶，则需要较温和的条件，此时可以在pH66.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。细胞核纯度的鉴定，可以从两方面进行，用光学显微镜或电子显微镜进行形态观察和生物化学方法进行酶活力的测定，某些细胞质的酶（如过氧化氢酶、碱性磷酸酯酶、淀粉酶和脂酶等），在纯细胞核制品活力应较低或检查不出来。本实验以动物肝脏为材料用柠檬酸的方法分离细胞核，用光学显微镜观察细胞核的形态。操作方法一、细胞核的分离实验前2

5、4小时内饥饿动物使成空腹，然后将动物断头杀死，取出肝脏，在生理盐水溶液中充分漂洗，用滤纸把液体吸干，将肝脏放入-20低温冰箱过夜待用。取3g肝脏剪成小块，按1：10（重量：体积）加入1.5%柠檬酸溶液，用玻璃匀浆器或组织捣碎器，破碎细胞，（注意不要把细胞核破坏）如果用高速组织捣碎机，要捣3次，每次510秒钟。（转速为10 00020 000r/min）然后把捣液用4层纱布过滤，滤液以800900r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀再用1.5%柠檬酸溶液洗1次，然后将沉淀再悬浮于1mL0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸溶液中制成悬液。将离心管内预先加好8mL0.88mol/L蔗糖-1.5

6、%柠檬酸溶液，并将上述悬液置于0.88mol/L蔗糖柠檬酸溶液之上以1 000r/min离心10分钟，即可得到较纯的细胞核沉淀。二、细胞核纯度鉴定用玻璃棒碰一下细胞核沉淀与完整肝细胞，分别放在载玻片上轻涂，然后加一滴台盼蓝（trypan bluc）染色液于玻片，即可在光学显微镜下进行观察，高纯度的细胞核制品必须在计数400个核中不能有个完整的细胞；在1 000个细胞核中不能有一个带有细胞质的核。试剂和器材试剂 1. 0.9%氯化钠溶液 2. 1.5%柠檬酸溶液 3. 0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸溶液 4. 0.88mol/L蔗糖-1.55柠檬酸溶液 5. 台盼蓝染色液：取0.4g台盼蓝，0.81g氯化钠，0.06g磷酸二氢钾和0.05g羟基苯甲酸盐于95ml，重蒸水中