圣和散对脑胶质瘤细胞诱导分化的研究

1、圣和散对脑胶质瘤细胞诱导分化的研究【关键词】圣和散；,脑胶质瘤；,分化摘要：目的观察圣和散对脑胶质瘤6细胞株体外生长及诱导分化的作用。方法用圣和散处理脑胶质瘤6细胞，采用甲基噻唑基四唑(TT)比色法检测圣和散对6细胞增殖的抑制作用,以免疫组化SAB法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和-y表达。结果圣和散可显著抑制6细胞体外增殖，并呈现时间、剂量依赖性。在终浓度为5g/l和10g/l时,对6增殖的抑制率达(49.621.13)%和(69.381.42)%，明显优于对照组P0.01。免疫组化可见SHP组较对照组GFAP表达明显增强，-y表达下降。结论圣和散对胶质瘤6细胞系的增殖有明显的抑制作用，能

2、通过诱导分化降低脑胶质瘤细胞恶性程度。关键词：圣和散；脑胶质瘤；分化InduingDifferentiatinEffetfShenghePdern6BrainGliaellsAbstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsfShenghePder(SHP)ntheprliferatinandinduingdifferentiatinfbrainglia6elllineinvitr.ethdsBrainglia6elllineas-ulturedithSHP.ethylthiaglytetragliu(TT)asusedteasurethelevelftheprlifer

3、atinf6ulturedithSHP.TheexpressinsfglialfibrillaryaidiprtEin(GFAP)and-yf6ellseredetetedbyiunhistheialSABethd.ResultsTheprliferatinf6asbviuslyinhibitedbySHPinanentratin-andtie-dependentanner.Theinhibitryrateas(49.621.13)%and(69.381.42)%inSHPat5g/land10g/l,parediththentrlgrup,thereasasignifiantdifferen

4、e(P0.01).TheexpressinfGFAPasbviuslyenhanedand-ydereasedsignifiantlyin6ellsulturedithSHP.nlusinSHPaninhibittheprliferatinf6anddereasealignantdegreebyinduingdifferentiatinfthe6ells.Keyrds：ShenghePder;Glia;Differentiatin脑胶质瘤是常见的脑肿瘤之一，由于其位置的特殊性和肿瘤本身的高侵袭性，手术难以彻底切除，术后复发率高，即使结合放化疗,预后仍很差1,2。圣和散是我院多年来用于治疗脑胶质

5、瘤的方药，它能否抑制脑胶质瘤增殖，诱导其分化是本实验研究的目的。1材料与方法1.1材料鼠源性胶质细胞瘤6细胞系引自第四军医大学西京医院;DE细胞培养基美国Gib公司;甲基噻唑基四唑(TT)、碘化丙锭PI、GFAP单抗、免疫组化SAB试剂盒美国Siga公司；-y单抗英国Nv公司;酶联免疫仪华东电子管厂DG5031型。1.2方法1.2.1细胞培养鼠源性胶质细胞瘤6细胞常规培养于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、100g/l庆大霉素的DE培养液中，在37、5%2、饱和湿度培养箱内传代培养。2d换液1次，0.25%胰酶消化，传代。1.2.2药物处理将中药SHP主要含党参、太子参、玄参、炒白术、薏苡

6、仁、土鳖虫、白花蛇舌草、肉苁蓉、蟾蜍、甘草经多酶乳化流程水提后3，喷雾得枯燥粉末，取适量磷酸盐缓冲液PBS溶解，上清用0.22的滤过膜过滤，配制成浓度10g/l的药液。1.2.3细胞生长抑制测定取对数生长期6细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,10%胎牛血清DE培养基配制成104个/l单细胞悬液,取100l(含103个细胞)参加96孔板中,培养4h,细胞贴壁,分为实验组(加SHP,终浓度分别为2.5,5,10g/l)和空白对照组(不加SHP),培养于37,5%2培养箱中培养,72h后,参加TT10l/孔,继续培养4h,吸去培养液,参加DS100l,将培养板振荡5in,20in以内以570n为测试波

7、长,630n为参考波长,在全自动酶标仪上读取各孔吸光度(A值),每组8孔。肿瘤细胞生长抑制率的计算：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值100%。1.2.4免疫组化SAB染色法检测GFAP和-y表达在规定培养时间取SHP处理组和对照组的6细胞爬片,洗涤后经纯丙酮室温固2030in,蒸馏水洗;纯甲醇加H22至0.5%,室温浸泡30in。蒸馏水洗3次；滴加正常山羊血清封闭液,室温20in后甩去多余液体；分别滴加适当稀释的一抗(1100)GFAP(小鼠IgG)和-y单抗,371h,0.1l/LPBS洗2in3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,3720in,0.1l/LPBS洗2in3

8、次;滴加试剂SAB,3720in,0.1l/LPBS洗5in4次;室温下DAB显色,蒸馏水洗涤,在400倍光镜下观察,阳性反响细胞核呈棕色或棕黄色。PBS代替一抗作空白对照。每张切片随机抽取视野，至少计算1000个细胞，阳性细胞所占比率为GFAP和-y表达的百分数。1.2.5统计学处理所得数据以s表示,数据分析采用单因素方差分析。数据由SPSS10.0软件包处理,P0.05为显著差异性。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1SHP对6细胞增殖的抑制作用SHP对6细胞增殖有显著的抑制作用,且存在时间、剂量与抑制率的量-效关系。结果见表12。表1时间与抑制率的量-效关系略与24h比拟，*P0.05表2

9、剂量与抑制率的量-效关系略与SHP2.5g/l比拟，P0.052.2SHP对6细胞GFAP和-y表达的影响在SHP实验组和对照组6细胞呈现不同程度的阳性反映,阳性反响细胞核呈棕色或棕黄色。SHP实验组和对照组比拟GFAP表达明显增加，-y表达减少,统计学有差异显著(P0.05)，且存在量-效关系。结果见表3。3讨论脑胶质瘤亦称脑神经胶质细胞瘤，包括多种发生于神经外胚层的肿瘤，约占颅内肿瘤的30%70%4。脑恶性胶质瘤的生物学特征是侵袭性生长,与周围正常脑组织无明显界限,尤其是位于功能区肿瘤,手术难以彻底切除，单纯手术预后极差,50%死于6个月内,5年生存率仅6%,结合放化疗仍难获得理想疗效2，

10、5。究其原因除手术因素外，胶质瘤细胞对放化疗的拒抗，成为进步疗效的主要障碍2。表3SHP对6细胞GFAP和-y表达略与对照组比拟，*P0.05，P0.01诱导分化治疗是治疗脑胶质瘤的新途径，它是针对肿瘤细胞的发育缺陷,通过诱导使低分化的肿瘤细胞进一步分化成为接近正常的“成熟细胞,致使大量细胞退出增殖周期转入静息状态,从而起到治疗的作用6，7。肿瘤细胞的增殖才能与其分化程度有着亲密的关联，肿瘤细胞分化越差,增殖越快。研究说明,GFAP是判断胶质细胞分化程度的可靠指标，GFAP是主要存在于星形细胞中的一种中间丝机构蛋白。其表达与星形细胞的发育和分化有亲密的关系。随着星形细胞的成熟,GFAP的表达逐

11、渐增强8。本实验中，5g/l与10g/lSHP均能明显上调GFAP的表达，且存在量-效关系。-y基因是一种控制细胞增殖和分化的原癌基因,具有调节细胞增殖和凋亡的双重作用。-y高表达使细胞具有高度增生潜能，同时还抑制了细胞的分化。在脑胶质瘤中存在-yRNA异常过量表达，-y基因表达异常增加与胶质瘤的发生、开展亲密相关,其表达程度也是评价胶质瘤生物学行为和患者预后的有价值的参考指标9，10。本实验显示，SHP能下调-y蛋白表达，诱导6分化，促使恶性向良性转化。提示SHP抑制胶质瘤的生长,与调节GFAP和-y蛋白诱导肿瘤细胞分化有关。参考文献：1LasER，ParneyIF,Huang,etal.S

12、urvivalfllingsurgeryandprgnstifatrsfrreentlydiagnsedalignantglia:datefrtheGliautesPrjetJ.JNeursurg,2022,99(3):467.2atsutani.heraditherapyfrbrainturs:urrentstatusandperspetivesJ.IntJlinnl.2022,9(6):471.4张纪.深化开展胶质瘤综合治疗及其根底研究J.中华神经外科杂志，2022,19(1):1.5张永禄,杨天恩.肿瘤放射治疗学.北京:北京医科大学中国协和医科大学结合出版社，1993：737.6Lins

13、keyE,GilbertR.Glialdifferentiatin:arevieithipliatinsfrnediretinsinneurnlgyJ.Neursurgery,1995,36(1)：1.7uevasP,Diaz-GnzalezD,Dujvny.Differentiatin-induingativityfneyininulturedratgliaellsJ.NeurlRes.2022,26(4):401.8SadatT,YshidaJ,akabayashiT,etal.NeapprahfrthetreatentfedallblastabytransfetinithglialfibrillaryaidiprtEingeneJ.Surgnl,1996,5(2):69.9hangY,huFP,HuangHP,etal.Inhibitin