人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARC mRNA及其蛋白表达

1、人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARC mRNA及其蛋白表达【关键词】人眼ExpressinfSPARRNAandSPARprtEininhuantrabeulareshrkandulturedhuantrabeulareshrkellsinvitr【Abstrat】AI:Tinvestigatehetherseretedprteinaidirihinysteine（SPAR)andSPARRNAareexpressedinhuantrabeulareshrk（T）andulturedhuantrabeulareshrkells（Ts）andtexplretherlesfSPARprt

2、eininthepathgenesisfpriarypenangleglaua(PAG).ETHDS:RTPRandesternBltereusedtdetetSPARRNAandSPARprteinandiunfluresenestainingfulturedTsasperfredbyantiSPARantibdy.RESULTS:RTPRfTandTsusingSPARspeifipriersftheRNAdisplayedthepresenefthepreditedbandfapprxiately300bp.esternBltshedaprteinbandf43Ku.NLUSIN:Hua

3、nTandTsanexpressSPARRNAanditsrrelativeprtein,hihinfluenestheauulatinanddegradatinfextraellularatrix.【Keyrds】trabeulareshrk；trabeulareshrkells；seretedprteinaidirihinysteine；extraellularatrix；priarypenangleglaua【摘要】目的：研究人眼小梁组织（T）及体外培养的人眼小梁细胞（Ts）是否可以表达酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（SPAR)RNA及SPAR蛋白.探讨SPAR蛋白在原发性开角型青光眼（PAG

4、）发病机制中的作用.方法：分别采用RTPR和esternBlt方法，对小梁组织和细胞进行检测，用抗SPAR蛋白免疫荧光染色方法对细胞进行染色.结果：组织和细胞RTPR均在300bp处出现预期的电泳条带，组织和细胞esternBlt在r为43103处出现蛋白条带.Ts抗SPAR免疫荧光染色表现为胞质均匀着色.结论：T组织及体外培养的人眼Ts均可表达SPARRNA及其相关蛋白，并起着调节细胞外基质（E）的生成和降解作用.【关键词】小梁组织；小梁细胞；酸性富含胱氨酸分泌型蛋白；细胞外基质；原发性开角型青光眼0引言小梁网（trabeulareshrk,T）临管区的邻管组织（juxtaanaliular

5、tissue,JT）是形成房水流出阻力的重要部位，它是由小梁细胞（trabeulareshrkells,Ts）和细胞外基质（extraellularatrix,E）组成的无定型组织层.E在细胞外的表达处于持续的重塑状态.其合成和降解是调节房水流出阻力的一个重要环节1.研究表明酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（seretedprteinaidirihinysteine，SPAR）在调节E的合成和降解中起着重要的作用.它是一种细胞外基质相关糖蛋白的调节蛋白，又称为骨连蛋白，由3个结构域组成，r为43103.在多种组织中都发现了SPAR基因和其相关蛋白的表达，并起着调节细胞黏附、增殖、E的合成/转化以及E与

6、细胞连接的作用2.我们研究人眼T组织和体外培养的人眼Ts是否表达SPARRNA及其相应的SPAR蛋白，以进一步探讨改善房水流出、调节眼压（intraularpressure,IP）的机制以及原发性开角型青光眼（priarypenangleglaua,PAG）的发病机制.1材料和方法1.1材料DE培养基、Trizl总RNA提取试剂盒、RTPR试剂盒、Taq酶均购自Gibi公司;BA蛋白定量试剂盒（Piere公司）；羊抗人SPARpAb（SantaGruz公司）；荧光素标记的兔抗山羊IgG（华美技术有限公司）.人眼T组织来自角膜移植供眼，皆为死后12h以内剥离的T组织，分别用于细胞培养及组织SPA

7、RRNA提娶RTPR及SPAR蛋白esternBlt检测.1.2方法1.2.1人眼Ts体外培养行人眼Ts体外培养组织学鉴定3，取传3代生长良好细胞用于实验.1.2.2组织和细胞总RNA提取取0.1gT组织，加1LTRIzl，匀浆，加氯仿、异丙醇沉淀RNA，离心，加DEP水配制的乙醇，-20保存，选用A260n/A280n值近似2.0者用于RT反应.细胞RNA提取：冰上收集传3代Ts（每份样品约3106个细胞），加入1LTRIzl，注射器内反复抽提，其余同组织RNA提取.1.2.3组织和细胞SPARRNARTPR分析1.2.3.1引物设计参考文献4的方法，扩增长度300bp，内参照采用atin，

8、扩增长度451bp.1.2.3.2逆转录反应DNA合成采用20L反应体系，42温育15in,99加热5in,55in终止反应.1.2.3.3RR扩增采用20L反应体系.PR方案：94预变性5in，94变性60s,50退火60s,72延伸60s,共35个循环.1.2.3.4产物鉴定取5LPR反应产物,15g/kg琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察有无特异性条带.1.2.4T组织及TsSPAR蛋白esternBlt分析分别取T组织和传3代Ts，加入膜蛋白裂解液，匀浆，离心，收集沉淀,-70保存待用.稀释并定量细胞和组织蛋白样品，取样品50L，行SDSPAGE变性电泳，考马斯亮兰染色.PVD

9、F转膜，脱脂牛奶封闭，依次加入第一抗体（羊抗人SPARpAb，1500）、第二抗体（辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，1500），DAB显色，扫描图像.1.2.5免疫荧光细胞染色取生长于盖玻片的传3代人眼Ts，固定，分别加一抗（山羊抗人antiSPARIgG）及荧光素标记二抗（兔抗羊Ab）行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞内SPAR表达.采用PBS代替一抗孵育细胞，作为阴性对照.2结果2.1人眼Ts培养T组织贴壁后714d即有细胞自边缘爬出，倒置显微镜下观察细胞成多角型、梭型，融合后为介于内皮与上皮细胞中间形态的扁椭圆形，透射电镜下可见胞体表面有突起及微绒毛，细胞器丰富，抗NSE、抗

10、vientin染色阳性，抗VIIIAg染色阴性.2.2组织及细胞SPARRNARTPRPR扩增35个循环所获产物电泳的结果可见atin在451bp处明显表达，T组织和体外培养的人眼Ts均可表达SPARRNA，在300bp位置出现电泳条带（图1）.2.3组织及细胞SPAR蛋白esternBlt检测T组织和体外培养的人眼Ts均可表达SPAR蛋白，在r为43103处出现明显蛋白条带，与纯SPAR蛋白电泳位置相同（图2）.2.4Ts抗SPAR免疫荧光染色抗SPAR染色呈阳性，可见胞质均匀荧光分布（图3），以PBS代替一抗的对照组胞质内无荧光显示.3讨论PAG的发病机制仍不清楚.近年来研究表明T组织，尤

11、其是临管区E的异常堆积造成的房水引流阻力的增加，在PAG的发病中起着重要的作用.前房灌注的方法发现黏多糖降解酶和基质金属蛋白酶（Ps）能够显著降解E，从而产生调节IP的作用.骨连蛋白/SPAR是一种r为43103分泌型糖蛋白，包括了血小板反应蛋白1和2，tenasins和骨桥蛋白.SPAR在体内的两个基本功能为抗黏附和抗增殖作用.原位杂交和免疫组化的研究表明很多种组织在重塑、正常发育和损伤修复过程中出现高水平的SPARRNA和SPAR蛋白的表达.在眼部研究发现体外培养的角膜细胞能够表达SPARRNA,并合成相应的SPAR蛋白.在角膜基质损伤和修复过程中SPAR合成和沉积增加，并将此作为角膜损伤

12、修复的一个标志5.SPAR敲除的裸鼠表现为早期发生晶体浑浊，成熟迟缓，说明SPAR是维持正常发育和晶体透明的重要因素6.SPAR在对细胞及E的调节过程中表现为抑制细胞伸展，松解局部连接，特别是E与细胞骨架中的肌动蛋白相连接的位点；通过调节血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI1）、纤维连接蛋白、层黏蛋白、血小板反应蛋白1的水平而刺激P1，2，9的生成，产生降解组织基底膜和E的作用.但是SPARRNA及其相应蛋白在T组织及Ts是否有表达，以及相关的调节因素?本实验结果显示T组织和体外培养的Ts均可表达SPARRNA，表现为在300bp处出现一明显的RNA电泳带.同时在T组织和体外培养的Ts中该RNA可

13、表达出相应的蛋白，esternBlt检测发现在r为43103处出现蛋白条带，这与Glebieski等7对SPAR的研究相符.说明SPARRNA及其相应蛋白影响着T组织临管区E的生成和降解，进而产生对房水流出及眼压IP的调节.我们实验中的人眼T组织取自角膜移植供眼，供体年龄为30岁，因此无法得知SPAR的表达随年龄变化的改变情况.已知E在T的堆积与年龄的增长有关，因此推测随年龄的增长SPAR的表达很可能会出现下调，而SPAR功能的改变会继发E代谢的异常，进而导致IP升高.但是在PAG时SPAR的表达是上调还是下调，程度如何，以及什么干预因子能够影响到其表达方面还需进一步研究.【参考文献】1Bra

14、dleyJ,VrankaJ.EffetfatrixetallprtEinasesativitynutflinperfusedhuanrganultureJ.InvestphthallVisSi,1998,39(13):2649-2658.2BrekkenRA,PulakkainenP,GravesD,etal.EnhanedgrthftursinSPARnullieisassiatedithhangesintheEJ.JlinInvest，2003,111(4):487-495.3张文强，杨新光，郭斌，等.压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响J.第四军医大学学报，2003,24(9):802-804.4BradshaAD,SageEH.ExpressinandpurifiatinfrebinanthuanSPARprduedbybaulvirusJ.lellBilResun，2000,3(6):345-351.5AbeK,HibinT,ishiaH,etal.TheytkineregulatinfSPARprdutinbyrabbitrnealepithelialellsandfibrblastsinvitrJ.rnea,2004,23(2):