培养基适用性检测操作规程

1、 第 页文件类型工作文件文件名称培养基适用性检查操作规程起草人： 审核人：批准人： 起草日期： 审核日期：批准日期：颁发部门质量部颁发数量2执行日期分发至存档（1）质量部（1）版本号01分发号1.0目的和范围无菌检测用的培养基和细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基均应进行培养基适用性检查，保证微生物检测用的培养基符合微生物相关检测要求。适用于无菌培养基和计数培养基的适用性检查。2.0依据US-SMP-24-004 微生物管理制度2015版 中国药典3.0 职责QC：按照本操作规程对无菌培养基和计数培养基的适用性检查进行检验、判定，并对检验结果负责。QA：对本规程的有效执行承担监督检查的职责。4.0

2、工作程序4.1无菌培养基适用性检查4.1.1 仪器设备 恒温恒湿培养箱、洁净工作台、电子天平、立式压力蒸汽灭菌锅、酒精灯、涡旋仪、三角瓶、试管、移液枪等4.1.2 培养基胰酪大豆胨液体培养基：按照胰酪大豆胨液体培养基说明书上的配方进行配制硫乙醇酸盐流体培养基：按照硫乙醇酸盐流体培养基说明书上的配方进行配制4.1.3 菌种和菌液制备4.1.3.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌种传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。4.1.3.2 菌液制备4.1.3.2.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆冻琼脂培养基或胰酪大豆冻液体

3、培养基中，于3035培养1824小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，备用。4.1.3.2.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于3035培养1824小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，备用。4.1.3.2.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基中，于2025培养2448小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，备用。4.1.3.2.4接种黑曲霉菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，于2025培养5

4、7天，加入35ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子菌悬液，备用。4.1.3.3菌液计数 4.1.3.3.1菌液经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度3个以上重复平皿菌落平均数稀释倍数5注：菌落计数时每种菌液应取3个平皿计数，并取平均值。4.1.3.3.2金黄色葡萄球

5、菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种至胰酪大豆冻琼脂培养基中，置3035培养48小时；白色念珠菌、黑曲霉分别接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基，置2025培养72小时。4.1.4 检验方法取每管装量为12ML的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ML的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。4.1.5 结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌培养基管生长良好，判定该培养基的灵敏度检测符合规定。

6、4.2 计数用培养基灵敏度检查4.2.1 仪器设备 恒温恒湿培养箱、洁净工作台、电子天平、立式压力蒸汽灭菌锅、酒精灯、涡旋仪、平板、三角瓶、试管、移液枪等4.2.2 培养基胰酪大豆胨琼脂培养基：按照胰酪大豆胨琼脂培养基说明书上的配方进行配制沙氏葡萄糖琼脂培养基：按照沙氏葡萄糖琼脂培养基说明书上的配方进行配制4.2.3 菌种和菌液制备4.2.3.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌种传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。4.2.3.2 菌液制备4.2.3.2.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆冻琼脂培养基或胰酪大豆冻液

7、体培养基中，于3035培养1824小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，备用。4.2.3.2.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基中，于2025培养2448小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，备用。4.2.3.2.3接种黑曲霉菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，于2025培养57天，加入35ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子菌悬液，备用。4

8、.2.4 检验方法4.2.4.1待检查的培养基4.2.4.1.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆冻琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；4.2.4.1.2取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72小时，计数。4.2.4.2对照培养基4.2.4.2.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1

9、ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆冻琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；4.2.4.2.2取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72小时，计数。 4.2.5结果判断被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。4.3 菌液梯度稀释方法参考例：稀释10倍：取0.5ml样液加入到4.5ml已灭菌氯化钠注射液后，放在涡旋仪震荡（2800次/min）2分钟充分混匀，就成为稀释10倍的样液；稀释100倍：取0.5ml样液（稀释10倍的样液）加