锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响

1、锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响【关键词】锰;人脐静脉内皮细胞;凋亡;半胱天冬酶3(aspase3);半胱天冬酶8(aspase8)摘要：目的探究锰对人脐静脉内皮细胞系huve-304细胞生长周期及半胱天冬酶3(aspas3)、半胱天冬酶8(aspase8)表达的影响。要领以100800l/l)的氯化锰别离处置惩罚huve-304细胞2472h后，四甲基偶氮噻唑蓝(tt)法检测ev-304细胞的生长活性；流式细胞仪f检测细胞凋亡环境；卵白印迹法esternblt检测huve-304细胞在，氯化锰半数按捺浓度(i50)400l/l作用24h时aspase8、aspase3的表达。效果氯化

2、锰可呈时间及剂量依靠性按捺huve-304细胞的增殖和诱导细胞凋亡,按捺率为2234%9094%，凋亡率为1020%9873%。氯化锰24hi50约为400l/l，在此浓度下，huve-304细胞aspase8、aspase3表达明显增高,(p005)。结论氯化锰可以或许按捺huve-304细胞的增殖，呈显着的时效和量效干系。aspase8、aspase3表达增高在细胞增殖和凋亡中起紧张的作用，大概是其作用机制之一。关键词：锰;人脐静脉内皮细胞;凋亡;半胱天冬酶3(aspase3);半胱天冬酶8(aspase8)effetfanganesengrthfhuve-304ellsandexpres

3、sinfaspaseguxiapeng,huangguxiang,uqing,etal.departentfpreventiveediin,edialllege,uhanuniversityfsieneandtehnlgy,(uhan430080,hinakeyrds：anganese;huve-304ells;apptsis;aspase3;aspase8锰可以通过诱导细胞产生不配对的电子自由基形成大量的过氧化物及影响细胞能量代谢等途径诱导细胞凋亡而发挥毒性作用1,2,但对细胞凋亡相干基因半胱天冬酶8(aspase8)、半胱天冬酶3(aspase3)及卵白产物的影响研究较少。本研究通过体外试

4、验，不雅察锰对人脐静脉内皮细胞系huve-304细胞生长及aspase8、aspase3表达的影响，探究锰诱导细胞凋亡分子机制。1质料与要领11重要试剂及抗体氯化锰(天津博迪化工)，分子量1977,纯度99%,溶解于二甲基亚砜ds，分装备用。rpi-1640造就基(美国gib公司)；胎牛血清025%的胰酶(中山凌飞公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(tt,美国siga公司)。aspase3、aspase8一抗为鼠抗人，二抗为羊抗鼠(美国晶美生物工程)。12要领121细胞和细胞造就huve-304细胞株(武汉大学细胞收藏中央)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/l及链霉素100g/l的rpi-164

5、0造就基中37、5%2条件下传代造就。取对数生恒久、生长精良、细胞活性大于98%的细胞举行实行。122细胞生长活性检测接纳tt比色法，取对数生恒久的huve304细胞举行实行，将差异浓度的氯化锰100800l/l参加10%胎牛血清fs的rpi-1640的造就基中，调细胞浓度为5105/l，接种于96孔，每种剂量浓度为一组，每个浓度3个平行孔，置37、5%2造就箱造就差异时间24，48，72h后，每孔加20ltt，造就4h，弃tt，每孔加ds150l，充实溶解。选择490n波长，酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(a)值。huve-304细胞的生长按捺率=1-实行组均匀a值/比较组均匀a值100%。

6、123流式细胞仪检测细胞凋亡用荧光素标识表记标帜的膜联卵白v(annexin-v-fit)及碘化丙啶pi双标流式细胞仪检测细胞凋亡，分为差异浓度实行组及比较组。别离参加终浓度为100800l/l的氯化猛作用24h，用70%乙醇4结实2h，磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液洗3次，离心去上清。用结合缓冲液37孵育60in，195l细胞悬液加5lannexin-v-fit，混匀，室温10in。用缓冲液洗涤细胞1次，在190l结合缓冲液中重悬，然后再加10l20g/lpi，流式细胞仪检测。124细胞卵白质样品制备及卵白定量经处置惩罚后的细胞立即弃去造就液,洗涤,离心,加预冷的细胞裂解液(01l/lnal,

7、001l/ltrishl,ph76,0001l/l乙二胺四醋酸edta,100g/l卵白酶按捺剂苯甲基磺酰氟(psf),2g/l，亮肽素(leupeptin)01l,裂解30in,然后于10000g离心10in,取上清备用。以上全部操纵均在4下举行。测定卵白,并调各组卵白浓度同等。125卵白印迹法(esternblt)esternblt要领检测aspase3、aspase8,x线曝光显影,软件举行扫描定量,每个浓度组重复3次,取均值代表测定效果。13统计阐发应用spss110统计软件举行t查验、单因素方差阐发(anva)。2效果21锰对huve-304细胞增殖的影响锰对huve-304细胞生长

8、呈时间剂量依靠性,锰染毒造就24，48，78h后，huve-304细胞生长按捺率别离为100l/l(2234822)%，(2747851)%，(3807986)%；200l/l(3362969)%，(4256095)%，(5935236)%；400l/l(5503620)%，(6212195)%，(6960377)%；800l/l(7606151)%，(8129154)%，(9094128)%，各组比力差异有统计学意义(p001),24hi50为400l/l。22锰诱导huve-304细胞凋亡环境(表1)锰对huve-304细胞凋亡具有诱导作用,浓度为100l/lnl2造就huve-304细胞

9、24h,即可引起细胞显着凋亡,并随氯化锰剂量的增长呈剂量-反响干系。表1差异浓度氯化锰诱导huve-304细胞的凋亡率略注：与比较比力，*p001；n=323锰对huve-304细胞aspase3、aspase8表达的影响esternblt卵白印迹法检测效果表现,浓度为400l/l氯化锰染毒造就huve-30细胞24h后，aspase8和aspase3表达均显着升高,a值别离为(48803216)，(47631205),与比较组比力(9013161)，差异有统计学意义(p001)。3讨论aspase活性的变革是细胞凋亡的紧张调治机制。研究表白aspase是统统凋亡信号传导的配合通路3，4。此中

10、aspase8是殒命受体途径中最紧张的启始因子之一,该酶启动后可以直接激活效应aspase的级联反响,诱导aspase3、aspase6的活化,还可以作用于bid(bl-2家属促凋亡成员),被剪切后的bid转位至线粒体内,诱导线粒体膜电位的丧失和细胞色素的开释,后者与凋亡卵白酶激活因子-1apaf-1(apptsisassiatedfatr-1)和aspase9形成凋亡小体,启动卑劣aspase效应酶的激活,终极诱导细胞凋亡5。有研究表白，锰可通过改变相干基因的调控及表达诱导细胞凋亡6。本实行效果表现，氯化锰对人脐静脉内皮细胞增殖具有显着的按捺作用,并能诱导调亡呈显着的量效和时效的干系。当氯化

11、锰染毒浓度为400l/l时，huve-304细胞造就24h,其aspase8、aspase3的卵白程度显着升高,说明氯化锰可通过上调细胞aspase8、aspase3基因的表达来诱导其凋亡诱导。由于细胞凋亡受多基因网络的调治,因此氯化锰诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的机制尚需深化的研究。参考文献1alekiea.anganesetxiityisassiatininraspriarystriatalneurnsj.brainresbull,2001,55(2):225-228.2王悦,段春礼,张海燕,等.锰对多巴胺能神经元毒性的研究j.神经剖解学杂志,2001,17(1):57-61.3fujiura

12、s,suzuiyaj,yaaday.dnregulatinfbl-xlandativatinfaspaseduringretiniaid-induedapptsisinanadultt-elllinej.heatl,2022,4(5):328-335.4alahlantk,ei-deirys.appttithreshldisleredbyp53transativatinfaspase-6j.pans,2002,99(14):9492-9497.5lingv,dnardj.aspase-6isthediretativatrfaspase8intheythre-induedapptsispathay:absluterequireentfrrevalfaspase6prdainj.elldeathdiffer，2002,9(10):1046-1050.6he