01核酸提取技术相关实验04普通pcr分子

1、一、PCR：Takara ExTaq 体系组成： Takara ExTaq （5U/UL） 10*EXTaqBufferdNTP Mixture (各 2.5mM)Template正向引物负向引物 Dddw：:：:：:0.255 UL4 UL1.05 UL 2UL2UL35.7(加水至 50UL)步骤：灭菌蒸馏水10*EXTaqBuffer正向引物反向引物dNTP MixtureTemplate Takara ExTaq体系（ ）： ； 扩增的 DNA 放到-20 度冰箱保存。二、跑胶切割回收：（在跑胶的实验台上一定要带上手套，防止污染，也保护自身，且只限于跑胶试验区域使用，否则会污染其他或者

2、其他区域）1、 配 1%琼脂糖凝胶（ 50 UL 体系 ）：用称量纸片（抽屉里）电子天平取 0.4g 的琼脂粉（）； 配 40ML 的 1*10 的 TBST 缓冲液与 100ml 的三角烧瓶里；倒入琼脂粉摇匀，并转到微波炉中加热（一般是 50S,加锡箔纸封盖）溶解完全；用手套取出到凉水稍稍晾凉至温热后，加入核酸酶（Eb 替代物）2ul；要边加边摇匀，使之充分摇匀；1.11.21.31.4倒入组装好的电泳槽中（一般是三个大孔和两个小孔的，梳子要插到条带的一方，方便加样），冷凝 20min；胶凝后取胶放到电泳槽中，倒入电泳液至浸过凝胶；有红色1.51.61.7从冰箱中取出 MARK 和 load

3、ing buffer，加入 6ULloading buffer 到样品中混匀；然后用加样别加到凝胶的大孔中（要缓慢加，不要穿破凝胶，最后抢不要打尽以至于有空气使样品吹打出来）；MARK 加到小孔中的任一孔；盖上电泳槽，正负极要插对（红对对黑），打开电源调至 6080V，4060min。1.81.9观察条带（mark 或样品是否有条带显示）MARK 用 1000*/loading buffe+多大 KB 的除以 R 得到样品加多少体积2、切胶：1.1将已跑出条带的凝胶转至切胶机上（要用手套垫着），打开紫外荧光，盖上滤光板，将样品的条带形状切下（若太大可适当修剪，但不能切到有条带显示的地方）；1.

4、2用干净无菌的 EP 装切下来的凝胶，装好；3、胶 DNA 回收(通用型 DNA 纯化回收试剂盒，离心柱型)：回收 8100bp 的 DNA （80%回收率）产品组成：溶液 PC（Buffer PC）,平衡液 BL（BL），漂洗液 PW（PW），洗脱缓冲液 EB，吸附柱 CB2，收集管（2ML）试剂置于室温（1525）干燥条件下，在 28保存更长，若有沉淀则室温或者放置 37水浴预热至溶解。使用前检查平衡液 BL 是否出现浑浊，若有则 37水浴加热几分钟，即可澄清，溶液 PC含有指示剂，为 黄色，只是操作步骤：7.5柱平衡步骤：向吸附柱 CB2 中（吸附柱放入收集管中）加入 500UL 平衡液

5、 BL， 12000rmp；离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（洗涤平衡住）；将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入等倍体积溶液 PC（若凝胶重 0.1g，体积为 100UL）50水浴放置 10min 且不断温和转动，确保胶块充分溶解（若胶块过大，可切成碎块），胶块溶解完全后最好将溶液温度降至室温上柱；上平衡柱离心 12000rmp/1min;弃收集管废液，吸附柱放回收集管；向吸附柱加入 600UL 漂洗液 PW（使用前检查是否加入无水乙醇），静置 25min钟 12000rmp/1min 离心弃废

6、液，吸附柱放回收集管；重复上一步操作；将吸附柱放回收集管中，12000rmp/2min 离心，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。（漂洗液中的乙醇残留会影响后续酶反应（酶切， PCR）实验）将吸附柱放入一个干净的离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱液 EB1.11.21.31.41.51.61.71.8（ 一般用蒸馏水 ddw，方便后续做） 不少于 30UL，室温放置 2min，12000rpm/2min 离心，回收 DNA（为了提高回收量可重新再离一次）保存-20以防 DNA 降解。1.9克隆及转化：pMD18-T 是一种高效克隆 PCR 产物的载体，它是由 pUC1

7、8 载体在 Xba I 和 Sal I识别位点间 一个 EcoR V 位点，然后用 EcoR V 进行酶切使质粒线性化，并在它的 3端添加“T”构建而成。因其 3端带有一个突出的“T”尾，能高效地与带“A”尾 的 PCR 产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA 克隆是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。1、2、3、取出目的 DNA 和T 载体，ddw, 从-80取出 DH5大肠杆菌感受态均放入冰盒中； T 载体离心后放入冰盒中反应体系： 先加 ddw 1 UL 入 PCR 管中,再加入离心后的 T 载体，最后加入目的基因 DNA，轻弹混匀，小离心机离心，室温放置 10min；TA 克隆技

8、术（ TA cloning） 利用 Taq 聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有 3-5端外切酶校准活性的特点，可在 PCR 产物的 3端加上一个非模板依赖碱基“ A”。片段长度室温连接时间12kb1015min3kb 以上2030min 转化：1.将克隆后的载体加入到 DH5大肠杆菌中，放入冰盒 30min；42水浴 45 S，取出放入冰盒 2min；加入 500UL 的 SOC（或纯 LB）；预摇 45min；4.5000rpm/5min 离心，去上清 800UL（留 50100UL）；5.混匀涂板（涂布棒要无菌）过程无菌操作；6.37温箱培养 89h;挑单克隆：从温箱中取出已长

9、好单克隆的，用枪头挑单克隆菌落，打入已装入5ml 相应抗性LB 培养液中小摇（盖子稍微松，粘好胶带固定），过夜。提质粒：(小提)柱平衡： 向吸附柱 CP3 中加入 500UL 的平衡液 BL，12000rpm 离心 1min.倒掉收集管中的废液，将吸附柱从新放回收集管中。取 15ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，12000 离心 1min.吸出上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入 250UL 的溶液 P1，（检查是否已经加入 RnaseA）,使用移液枪或者漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。1.2.3.向离心管中加入 250 UL 溶液 P2，温和的迅速上下翻转 6-8 次，使菌体充3min.解，静置

10、4.向离心管中加入 350 ul 的溶液 P3，立即温和的上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm/10min.将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱 CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀，12000rpm/1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。向吸附柱 CP3 中加入 500UL 的去蛋白液 PD，12000rpm/1min,倒掉废液，CP3 放回收集管中。向 CP3 中加入 600UL 的 PW(检查是否加入无水乙醇)，12000rpm/1min, 倒掉废液，CP3放回收集管中。重复 8.将 CP3 放入收集管中，12000rpm/2m

11、in,，目的是将吸附柱中残余的漂洗液除去，开盖静置 5min.将 CP3 放入一个新的 EP 管中， 向吸附膜的中间部位滴加 80ULddw, 室温放置 2min,12000rpm/2min,将质粒溶液收到离心管中。测定浓度，纯度，2.5ul。-20保存。5.6.7.8.9.10.11.12.13.23kb1520min0.11kb510min酶切酶切指采用粘末端连接必须对目的 DNA 分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末酶切鉴定（10ul）、酶切回收（50ul）三、双酶切端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不

12、同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收 DNA 分子后再用另外一种酶切；先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免损失。步骤：一、实验材料准备材料：质粒 DNA。试剂：限制性内切酶、ddH2O。3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。二、单酶切1. 在 1.5 mL 灭菌离心管中依次加入：质粒 DNA：X L（约 1 g）。限制性内切酶：1 L（约 10 U）。（3）10buffer：2 L。（4）ddH2O：补足 20 L。

13、2. 混匀，做好标记。3. 37水浴 1-3 h。70水浴 10 min 中止反应。电泳检测酶切效果。酶切体系：（37/3h）DNA1g2.5UL10*H buffer2ul5X hoI1ul2.5EcoRI1ul2.5ddWTo 20 ulTo 50 ul（37.5）片段连接：T4 连接（10ul）TAKARA 连接体系：（16/过夜 8h）10*T4 DNA Ligase buffer2.5ul DN段 0.3 pmol载体 DNA0.03 pmolddWTo 25 ulLigase：连接酶NEB 连接体系：10*T4 DNA Ligase buffer2ulInsent DNA0.06 pmolddWTo 20 ulT4 DNA Ligase1ulVector DNA0.02 pmolT4 DNA Ligase1ul1. 在 1.5 mL 灭菌离心管中依次加入：质粒 DNA：X L（约 1 g）。限制性内切酶 1：1 L（约 10 U）。限制性内切酶 2：1 L（约 10 U）（3）10buffer：1 或 2 L。ddH2O：补足 20 L。2. 混匀，做好标记。3. 37水浴 1-3 h。70水浴