几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡的研究

1、几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡的研究【摘要】本研究评价几种临床常用的抗肿瘤药物顺铂DDP、羟基喜树碱(HPT)、高三尖杉酯碱(HHT)和米托蒽醌(IT)在白血病治疗中的作用，并阐发其在诱导Jurkat细胞凋亡的作用，为白血病的临床治疗提供新的理论根据和思绪。用AnnexinV/PI双参数流式阐发要领，检测这几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡和殒命的效应。结果表白：IT和HPT在加药处置惩罚早期4小时(P0.05)和后期第8小时(P0.05)都有显着的诱导Jurkat细胞凋亡的效应。HHT有显着诱导Jurkat细胞凋亡的结果，但各剂量组之间无明显差异。DDP在高浓度和长时间作用时才表

2、现较弱的细胞凋亡效应，显着弱于前3者。种种药物作用后均未不雅察到显着的细胞殒命效应。结论：IT诱导Jurkat细胞凋亡的作用最明显，AnnexinV流式阐发要领可作为一种可靠的临床药物挑选的要领。【关键词】抗癌药物；细胞凋亡；Jurkat细胞系；AnnexinVEffetfSeveralAnti-turDrugsnApptsisIndutininJurkatellLineKeyrdsanti-turdrug;apptsis;Jurkatellline;AnnexinV化疗是肿瘤治疗的一种紧张要领，新的抗肿瘤药物也不竭地涌现。海内涵上个世纪90年代上市的抗癌药物中化学合成药米托蒽醌(IT)、羟基

3、脲温顺铂(DDP)等少数几种抗癌药物，通过与DNA分子团结按捺核酸合成引起细胞殒命，这类药物称之为细胞周期非特异性药物。本研究选用米托蒽醌(IT)、顺铂(DDP)、羟基喜树碱(HPT)、高三尖杉酯碱(HHT)诱导Jurkat细胞凋亡，并通过AnnexinV/PI法检测细胞凋亡及细胞殒命比例，阐发差异作用时间以及差异药物浓度对Jurkat细胞凋亡的影响。质料和要领质料Jurkat细胞系由本实行室保存。顺铂DDP为齐鲁制药产物、羟基喜树碱HPT为黄石飞云制药厂产物、高三尖杉酯碱HHT为杭州民生药业公司产物、米托蒽醌IT为浙江瑞新药业公司产物；RPI1640为Invitrgen产物；AnnexinV

4、FIT/PI试剂盒购自晶美生物公司；贝克曼流式细胞阐发仪EliteEXP。诱导Jurkat细胞凋亡Jurkat细胞在5%2孵箱造就至对数生恒久，镜下计数为1106/l，参加24孔板，每孔1l细胞悬液。用无血清细胞悬液将顺铂、羟基喜树碱、高三尖杉酯碱和米托蒽醌药物配制成1g/l溶液；每组药物别离设4个浓度：12.5、25、50、100g/l；别离参加24孔造就板，作3个复孔。置于52孵箱造就。AnnexinV/PI流式双参数阐发1-3别离于参加药物作用2、4和8小时，汲取造就细胞悬液，用4预冷的PBS洗细胞2次，用250l团结缓冲液重悬细胞，使其浓度为1106/l；取100l细胞悬液，加5lAn

5、nexinV/FIT和10l(20g/l)的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS洗涤2次，举行流式细胞仪FAS阐发。AnnexinV-FIT/PI双参数举行调试，以此条件举行细胞凋亡和细胞坏死率检测。图1-5横坐标表现荧光强度，纵坐标表现细胞数，图中两个峰中的左边峰表现阴性峰，右峰表现凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。按照所测数据盘算细胞凋亡率和继发性坏死率。统计学阐发各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以XSD表现，多个均数的两两比力接纳?中国医学百科全书医学统计学?统计软件包(第三版)PES3.1软件举行查验。结果DDP对Jurkat细胞的诱导凋亡作用DDP各剂量组与比拟组未处

6、置惩罚组比拟，在其剂量为12.5g/l时，各个作用时间点上Jurkat细胞凋亡率均无显着变革；剂量为25g/l和50g/l时，在2小时和4小时Jurkat细胞凋亡率也无显着变革，而在作用8小不时Jurkat细胞凋亡率才有显着增高，别离为13.6%和23.9%，与比拟组比拟有明显差异P0.05。当DDP药物浓度增大至100g/l时，作用2小时和4小不时，Jurkat细胞凋亡率无变革，在8小不时Jurkat细胞凋亡率为19.9%，与50g/l剂量比拟，诱导细胞凋亡率不单没有显着差异，并且有所低落图1，这表白DDP的作用有药物饱和效应。HHT对Jurkat细胞的诱导凋亡作用HHT各剂量组的细胞凋亡率

7、与比拟组未处置惩罚组比拟均有显着增高P0.05。Jurkat细胞凋亡率与药物剂量干系不显着，但与作用时间显着成正比。12.5g/lHHT作用2、4和8小不时Jurkat细胞凋亡率别离是4.9%、20.4%和35.4%(P0.05)；25g/lHHT时别离为5.5%、12.1%和27.2%；50g/lHHT时别离为5.8%、12.2%和33.0%；100g/lHHT时别离是5.7%，12.1%和35.0%(P0.05)。差异药物浓度HHT在同一时间点之间诱导Jurkat细胞凋亡率没有显着差异图2。IT对Jurkat细胞的诱导凋亡作用与比拟组未处置惩罚组比拟，IT各剂量组在作用2小不时Jurkat

8、细胞凋亡率无显着差异，但随作用时间延伸均有显着增高P0.05。12.5g/l剂量组作用2、4和8小不时Jurkat细胞凋亡率别离是4.2%、20.5%和52.4%(P0.05)，25g/l组别离为4.9%、30.1%和68.9%，50g/l组别离是7.2%、37.9%和81.8%(P0.05)图3，100g/l组别离为6.6%，41.5%和84.1%，各作用时间点之间差异均有明显差异P0.05图4。Jurkat细胞凋亡率在药物低剂量时随剂量增大显着增高；100g/l组作用效应与50g/l剂量组没有显着差异，表现有剂量饱和效应。HPT对Jurkat细胞的诱导凋亡作用HPT各剂量组与比拟组未处置惩

9、罚组比拟，Jurkat细胞凋亡率均有显着增高P0.05，Jurkat细胞凋亡率随药物剂量增大和时间延伸而显着增高，12.5g/lHPT剂量组作用2、4和8小不时Jurkat细胞凋亡率别离是3.4%、20.9%和30.3%(P0.05)；而25g/l组别离为3.7%、19.1%和30.3%；50g/l组别离是5.9%、23.8%和44.6%(P0.05)，100g/l组别离是3.0%、15.8%和55.7%(P0.05)。HPT雷同剂量差异作用时间点的Jurkat细胞凋亡率均有明显差异(P0.05)图5；HPT差异剂量同一作用时间点的诱导Jurkat细胞凋亡率在2小时与4小时间没有明显差异，而两

10、者与8小时作用比拟均有明显差异(P0.05)。各药物组间诱导Jurkat细胞凋亡的比力顺铂、高三尖杉酯、米托蒽醌和羟基喜树碱4种药物间差异剂量组在作用2小不时诱导Jurkat细胞的凋亡率无显着差异，在4小时和8小不时各组间均有明显差异(P0.05，图6。药物诱导Jurkat细胞凋亡的强度依次为IT、HPT、HHT和DDP。各药物组诱导的Jurkat细胞殒命各药物组均未产生显着的诱导Jurkat细胞殒命的征象。DDP诱导Jurkat细胞殒命的效应随药物浓度的增高和作用时间的延伸而加强，在药物浓度为25、50和100g/l，作用8小不时诱导的Jurkat细胞殒命率别离为7.6%、9.9%和10.3

11、%。12.5g/lHHT短时间和长时间作用时细胞殒命效应均不显着，只在药物浓度为25、50和100g/l，作用4小不时表现薄弱的诱导Jurkat细胞殒命的效应，细胞殒命率别离为6.6%、5.2%和6.6%。IT只在低药物浓度12.5g/l和25g/l作用8小不时细胞殒命率别离为4.0%和4.5%图7，药物浓度增高时却并未产生显着的细胞殒命。而HPT那么只在增高药物浓度至50g/l和100g/l，长时间作用8小不时才产生细胞殒命，细胞殒命率别离为5.0%和9.6%。详见附表。Table.Effetfanti-turdrugsnapptsisfJurkatells(略)讨论多种化疗药物可以诱导肿瘤

12、细胞凋亡，如米托蒽醌(IT)、顺铂(DDP)、羟基喜树碱(HPT)，高三尖杉酯碱(HHT)等。有文献报道米托蒽醌可诱导人髓系白血病细胞凋亡4，并渐渐用于白血病的治疗。DDP曾用于治疗卵巢癌、前线腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨血瘤等多种实体肿瘤，均表现出精良的疗效，其机制是损伤线粒体成效、使DNA断裂和按捺细胞发育5，比来有文献报道，DDP可通过引起D95聚拢成簇进而诱导凋亡6。然而，其较强的肾毒性限定了其临床利用。羟基喜树碱(HPT)和高三尖杉脂碱(HHT)均是从植物中提取的生物碱，具有明显的抗癌活性。HPT在临床上重要用于结肠、直肠癌、肺癌

13、及白血病等恶性肿瘤的治疗，也有很强的诱导人白血病细胞和消化体系肿瘤细胞凋亡的作用7，8。临床证实，HHT对急性粒细胞白血并急性单核细胞白血并红系白血病等种种急性非淋巴性白血病及慢性粒细胞白血病均有较好的疗效。研究表白，HHT可诱导人野生型P53白血病细胞、HL-60，K562和Jurkat细胞等凋亡，诱导机制大概是通过粉碎或改变线粒体跨膜电位或细胞色素、AIF的开释和aspase的活化等9-11，同时另有诱导白血病细胞分化和按捺转移的作用12。本研究按照比年的研究结果和临床白血病治疗的题目和近况，用可靠的AnnexinV/PI流式双参数阐发要领，比力了几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡的作

14、用，为办理临床白血病治疗的题目提供新的根据和思绪。细胞产生凋亡的早期，膜磷脂酰丝氨酸PS由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种磷脂团结卵白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧表露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜团结。因此，AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的敏捷指标之一。在细胞产生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸外翻的产生早于细胞核的变革。本研究团结断定细胞死活的核酸染料PI，利用AnnexinV/PI流式双参数阐发来区分凋亡细胞与殒命细胞，检测几种实行药物诱导Jurkat细胞凋亡和殒命的效应。本研究结果表现，各药物均表现差异程度的诱导Jurkat细胞凋亡的效应。DDP小剂量时无显着

15、诱导Jurkat细胞凋亡的效应，只在大剂量长时间作用时才表现出诱导Jurkat细胞凋亡效应。HHT和IT诱导Jurkat细胞凋亡效应均随药物剂量增大显着增高，但HHT各剂量组在差异时间点细胞凋亡率无显着变革，IT诱导Jurkat细胞凋亡效应随药物作用时间延伸而显着加强。HPT组差异药物剂量同一作用时间点诱导Jurkat细胞凋亡率在2小时与4小时间没有明显差异，但作用8小不时均有明显差异。IT诱导Jurkat细胞凋亡效应的强度显着强于其他3种药物，DDP只表现薄弱的细胞凋亡效应。前3种药物随剂量增大均表现出药物饱和效应。各药物组均未表现显着的诱导Jurkat细胞殒命的变革。DDP和HPT只在高药物浓度长时间作用时才表现薄弱的细胞殒命效应。HHT短时间和长时间作用时细胞殒命效应均不显着，只在药物作用4小不时表现薄弱的诱导Jurkat细胞殒命的效应。IT却只在