基因工程技术的基本工具

1、专题1基因工程基因的内涵基因是具有遗传效应的DNA片段DNA分子的结构磷酸二酯键特点：（1）两条脱氧核苷酸链反向平行盘旋成双螺旋结构（2）脱氧核糖和核酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架（3）两条链上的碱基通过氢键连接排列在内测原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区原核细胞的 基因结构调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子启动子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 真核细胞的

2、 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子基因工程的产物转基因大肠杆菌转基因小鼠转基因烟草基因工程什么叫基因工程？ 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。对基因工程概念的理解基因重组生物体外基因/DNA分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物克服了远缘杂交不亲和的障碍定向改造生物性状问题探讨：苏云

3、金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀” 限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针” DNA连接酶“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的

4、基本工具一、限制性核酸内切酶“分子手术刀” 限制酶分布在哪里？有何特点？断开的是什么化学键？作用结果怎样？磷酸二酯键ATGGCATCTTCGAA氢键主要从原核生物中分离纯化出来 1、来源： 2、特点：3、作用：4、结果：具有专一性识别某种特定的核苷酸序列，使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开形成两种末端黏性末端平末端切开磷酸二酯键限制性内切酶限制酶EcoRSma平末端平末端G A A T T C C T T A A G 中轴线C T T A A G A A T T C G C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C 黏性末端平末端切割D

5、NA分子时产生的两种不同末端限制酶的识别序列：能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。思考与探究 P7 （2）为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中

6、含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制性内切酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。二、DNA连接酶“分子缝合针”1、作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏

7、性末端和平末端(效率较低)2、种类：形成磷酸二酯键GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段GAATTCCTTAAG酶切GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG同一种DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个

8、缺口同时连接起来，不需要模板三、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”1、常用的运载体：质粒、 噬菌体衍生物、动植物病毒等质粒：主要存在于细菌等微生物体内。独立于拟核或染色 体DNA外的能进行自我复制的小型环状DNA分子大肠杆菌及质粒载体结构模式图运载体需具备的四个条件：有一至多个不同的限制酶切点，供外源DNA片段（基因）插入其中具有某些特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择能在宿主细胞内复制并稳定地保存注意：在基因工程操作中，运载体都是天然的质粒或病毒经过人工改造的小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分

9、子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4 DNA连接酶运载工具条件能自我复制具多个限制酶切位点具标记基因等质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子大多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究 P7 能在宿主细胞内复制并稳定地保存 有一至多个不同的限制酶切点，供外源DNA片段（基因）插入其中 具有某些特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ 迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究 P7随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中答案：C2. （多选）有关基