血小板活化与流式细胞仪分析

1、血小板活化与流式细胞仪分析1血小板活化使用流式细胞仪，同时分析血小板多个活化指标，灵敏、特异地检测全血中的血小板，了解血小板的反应性和活化进程血小板表面膜糖蛋白（GP）：PAC-1颗粒膜GP的表达量变化：CD62P直接使用全血，样本更接近生理状况操作步骤简便、用血量少、避免体外活化与血小板亚群丢失血小板减少患者也能精确分析血小板活化的三色荧光分析使用PerCP标记的泛血小板抗体CD61，特异地测血小板表面的活化指标，避免碎片等非特异干扰选择活化血小板特异的表面标记PAC-1，CD62P，检测血小板活化的不同阶段PAC-1 FITC：IgM型抗体，是血小板活化的早期标志，即活化的血小板膜糖蛋白复

2、合物。CD62P PE： IgG1型抗体，是血小板活化后颗粒释放的标志标本采集枸橼酸钠抗凝采血管顺序编号抽取静脉血，前2ml弃去不用抗凝管中注入2ml静脉血，轻轻混匀10分钟内完成血小板的激活和染色操作操作过程中注意减少人工激活血小板为评估血小板活化试验的有效性，采用正常人标本做平行阴性对照，正常人ADP激活标本做平行阳性对照血小板体外活化血小板激活剂：ADP，活化终浓度0.2uM试管内加入50ulADP，450ul抗凝全血轻轻混匀37C温育5分钟立即进行染色荧光染色Falcon管顺序编号，阴性对照为正常人未活化标本，阳性对照为正常人活化标本每一标本作2管：对照管和试验管加入相应BDIS抗体及

3、对照各10ulBDIS抗体FITCPEPerCP对照管 PAC-1+RGDSIgG1CD61试验管PAC-1CD62PCD61荧光染色对照管和实验管中各加入血标本5ul轻轻混匀，室温暗处孵育20分钟各管中分别加入2-8 C 1%多聚甲醛1ml，充分混匀，于2-8 C暗处固定10分钟24小时内上机，获取数据，分析结果流式细胞仪测定检查鞘液筒和废液筒，打开流式细胞仪做FACSComp，校正仪器打开CELLQuest软件，顺序摆放试验管调出获取条件，FSC和SSC选择Log模式，FSC-SSC点图中出现血小板细胞群FL3设阈值，获取条件为CD61阳性在FL1-FL2点图中，对照管目标细胞群位于左下脚

4、获取对照管及试验管的数据流式细胞仪分析CD61 vs SSC点图中设门，找到CD61阳性的血小板群门内做PAC-1 vs CD62P点图，进行双参数分析结果统计：PAC-1+，PAC-1+CD62+，CD62+ %PLT流式细胞仪测定注意事项使用枸橼酸钠抗凝采血时使用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用尽量避免标本受到物理震荡，减少人工激活取血后10分钟内进行染色操作加样时，不要将标本残留在Falcon管壁上临床意义直接测量循环血小板活化状态与反应性可测定凝血酶等诱导剂活化的血小板，即通过血小板体外活化，评估病人血小板的活化能力血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成临床意义心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性缺血性脑血管病与血小板活化有关子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治疗疗效监测总结使用BDIS三色荧光流式细胞