多酚氧化酶活性测定及控制

1、毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶(PPO)广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常 会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变 的防治提供思路。二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱 层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS电泳确定为 单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。在整个过程中，该酶

2、纯化了95. 66倍，产率为 2. 4%。同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 90066 100之间。2.2不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强，但酪氨酸所 测活性的变异系数大。面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦 粉中的PPO活性高，变异系数大。2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性，与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流 PPO活性高。2.4核桃组织

3、培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。2.5石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时，底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm，最适pH值为6.8, 最适温度为50C,反应时间不宜超过20min，反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳 定。抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。2.6纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有a一螺旋和B一折叠结构。与抑制剂作用后，莲 藕PPO活性显著降低，同时伴

4、随其二级结构中a-螺旋结构明显减少，表明莲藕PPO的活性 中心可能位于a-螺旋结构中。荧光分析表明，莲藕PPO与邻苯三酚(pyroGAllic Acid, PA) 作用后，酪氨酸残基荧光强度略有降低，入mAx位移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低， 入mAx红移2 nm；而与莲藕多酚(LoTus rooT polypHenol, LRP)作用后，莲藕PPO分子中酪 氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基荧光强度显著提高，且其最大发射波长分别蓝移6nm和红移 5nm。当加入异Vc钠后，Tyr和Trp残基最大发射峰显著红移，说明Trp和防残基位于一定 的疏水环境对维持PPO催化活性的优势构象至关重要

5、。2.7磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响以邻苯二酚为底物，莲藕PPO褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动 力学,Km为0.775mol/L,VmAx为11.150U/min。Vc对PPO有较强的抑制作用,反应动力学参 数Km为0.081mol/L,VmAx为3.243U/min，呈现反竞争性抑制，表现为褐变出现滞后，随Vc浓 度的增大滞后时间逐渐增长，且呈现S型趋势，并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下, 随着处理时间的变化,PPO活性呈现波动性。3.17A/m磁场强度下处理4H的酶液其反应动力 学曲线表现为S型,并建立了相应的反应方程。2.8南湖菱果中多酚氧化酶抑

6、制剂对其活性的影响南湖菱PPO催化反应的最适温度为30 0C，最适pH 6.5，最佳吸收波长420 nm，最大反应 速度VmAx=33.67 uniT/min，米氏常数Km= 0.286 mol/L。在3种抑制剂抗坏血酸、EDTA和 柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为0.3 mmol/Lo2.9二氧化氯(C1O2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶(PPO)的影响100mG / L浓度的ClO2处理鲜切藕片5min、10 min、15 min后，在贮藏期间能抑制PPO 的活性，而10 mG/L浓度对PPO的活性不起抑制作用反而促进了 PPO的活性.100 mG / L ClO2处理鲜

7、切藕片10 min抑制PPO的活性效果最好。2.10底物浓度、pH、温度对鲜切莲藕中PPO酶的影响鲜切莲藕的PPO活性最适反应底物浓度为0.02 mol/L，并且底物浓度与PPO活性的关 系完全遵循MicHeAlis-MenTen的酶促动力学性质。PPO最适pH值为7.O, pH对PPO的影 响显著，当pH4.0时，PPO活性显著下降，可见，调节pH值可有效地抑制PPO活力。PPO 活性的最适温度为35C，在o C-5C之间，莲藕的PPO活性受到明显的抑制。2.11抑制剂对多酚氧化酶活性的影响添加抑制剂可使莲藕PPO反应速率发生变化。苯甲酸I可与酶E结合生成无活性的二 元复合物EI,减小可供邻

8、苯二酚进攻的游离酶E的浓度，也就降低了酶一底物ES的浓度， 而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率ymAx，从而破坏了莲 藕PPO的正常催化氧化反应系统。2.12护色处理对多酚氧化酶活性的影响对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为EDTA浓度为0.25% , Vc浓度为0.1%、草酸浓 度为0.25%半胱氨酸浓度为0.7%、处理时间为8min。2.13气调包装对鲜切莲藕的保鲜效果采用8种不同浓度配比的O2、N2和CO2气体对鲜切莲藕进行包装，置于4C下贮藏， 定期测定鲜切莲藕VC的含量、多酚氧化酶活性、褐变度以及pH值变化，结果显示100% O2组处理的鲜切莲藕，其外观最好，

9、多酚氧化酶活性受到抑制。三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期 达到的目标3.1对多酚氧化酶的提取：匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高， 且可以直接用于研究）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0. 05mol / L，pH5. 4的预冷磷酸氢二钠.柠檬酸缓 冲溶液（含5%的PVPP），料液比为1： 2. 2，捣碎，搅拌，4。C下静置4H，抽滤，所得滤 液即为粗酶液。3.2 PPO活性的测定取浓度0. 05 mol / L，pH值7. 0的磷酸盐缓冲溶液1. 5 mL于1 cm比色皿中，加入 0. 1 mol / L的邻苯二酚溶液1. 0

10、 mL，ppo粗酶液0. 5 mL.混匀后在420 nm处比色，酶 液加入后开始计时，每30 s记录1次OD。随时间的变化值，以最初直线段的斜率（AOD/ t）计算酶活力.一个酶活力单位定义为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0. 001所需 的酶量.PPO相对活性=各处理组吸光度值/同组最佳处理组吸光度值X100%。3.3影响PPO活性的因素测定3.3.1温度对多酚氧化酶活性的影响在l cm比色皿中，加入浓度为O. 05 mol / L, pH值为7. 0的磷酸盐缓冲溶液1.5 mL, 0. 1 mol/L的邻苯二酚溶液1. 0 mL。在20-50C(间隔5C一个处理)下保温10 min,加

11、入 相同温度下保温10 mill的PPO粗酶液0. 5 mL。在30 S和l trim。测定03420值。3.3.2 pH对多酚氧化酶活性的影响分别配制pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的磷酸缓冲液，在1.2ml 0.2 mol/L的底物中分别加入上 述缓冲液1.6ml,30 0C水浴，再加入0.2 ml酶液，于420 nm处测OD值，计算酶活力。 3.3.3抑制剂对多酚氧化酶活性的影响方法1:抑制剂为抗坏血酸、EDTA和柠檬酸 在1.6 ml 25 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.5),1.2ml 0.2mol/L邻苯二酚溶液和0.2 ml酶液混合液中加入0.1 ml不同浓度的抑

12、制剂，以 0.1 ml蒸馏水代替抑制剂作为对照.按1.2.3节方法测PPO活性。预期结果：抑制剂抗坏血酸、EDTA和柠檬酸对南湖菱PPO的活性均有一定的抑制能 力，且随抑制剂浓度的增大，对PPO活性的抑制作用增强，其中，抗坏血酸的抑制效果最 好。方法2：抑制剂为抗坏血酸、亚硫酸钠用浓度为0 05 mol/L，pH值为7. 0的磷 酸盐缓冲配制不同浓度的抑制剂溶液.在1 m的比色皿中，分别加入上述抑制溶液1. 5ml， 0. 1 mol/L的邻苯二酚溶液1. 0mol，PPO粗酶液0. 5ml，在室温条件F测定PPO的活 性。预期结果：抗坏血酸和亚硫酸钠对PPO的活性有强烈抑制作用，抗坏血酸对P

13、PO活性 的抑制作用是将酶促反应的中间产物醍还原而抑制褐变；亚硫酸钠对PPO活性的抑制作用 也是将酶促反应的中间产物醍还原，同时还能与中间产物醍形成稳定的无色物而抑制褐 变.亚硫酸钠要考虑SO2,在制品中的残留。方法3：抑制剂为ClO2 4C冷藏的新鲜莲藕切成薄片，置于不同处理溶液(ClO2 处理浓度:0.10 mg/L, 50 mG/L,100 mG/L; ClO 2处理时间:5 min,10 min,15 min;处理后样品的 贮藏温度：4C )中，浸泡不同时间后取出，控干表面水分，以清水处理作对照(CK)处理的藕 片分别装入保鲜袋中置4C下挽口贮藏10d。每隔ld测定相关指标。对照组和处

14、理组均设3 个平行。预期结果：100mG/L ClO2处理l0min的鲜切莲藕褐变度最小。(4)方法4：抑制剂为Vc取6支试管，每支试管加入0.5 ml粗酶液、2 ml邻苯二酚溶液和2 ml磷酸盐缓冲液，并分别加入0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 ml质量浓度为0.026 G/L的Vc溶液，室温下反应S min，在波长420 nm下每隔1 min测定一次吸光度。预期结果：如图，不同质量浓度的Vc对莲藕多酚氧化酶活性有抑制作用，表现为褐变 推迟出现，即存在反应滞后期。随着Vc质量浓度的增加，滞后时间逐渐延长。, 8,12 mgl -M4.K mgfL o 5.206.24 fflg

15、/L1 3 S 7 9 II 13 15 17 19 21 23 25 时间/ mill不同Vc质量派度下酶袱的吸光度与时间关系曲线(5)方法5：抑制剂为鲜切莲藕保鲜剂组配正交试验试临兮L-芈院我恤%抗坏11?。,100. LD:2颂ql.W30.50CL S。L.aO4岫0.心0. 3。5O.SO。寄6口部0P ID1.007。一跖0.闽璀B0.卧d踣0. L0L：5090.300.3U0-=5010CCK)000新鲜莲藕切片，按上表对莲藕进行处理，沥干后用0. 04rnm厚LDPE袋真空包装，置于4C 下贮藏。用清水处理作对照。处理后的莲藕片每隔l周测定相关指标，重复3次。预期结果：PP0

16、活性在鲜切莲藕贮藏期间是呈增加的趋势，经保鲜液处理的样品在贮藏 末期仍然能保持在较高水平，保鲜剂的最佳组合为第9组A383C2D1，即0.3%L-Cys+0.5% Ca+0.%Vc 十 0.5%NaCl。(6)方法6：抑制剂为NAHSO3和硫脲对石榴PPO活性的影响 配制0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8 mol/ L的NAHS03和硫脲溶液，加入反应体系(包括石榴PPO提取液2ml,0.1mol/L的儿茶 酚1ml、不同pH的缓冲液2ml),以加入20%TGA 2ml反应液为对照，测定吸光度值，作出 吸光度-抑制剂浓度曲线，以确定适宜的抑制剂浓度。预期结果:反应液中抑制剂NAHSO

17、3浓度达0.2mmol/ L时酶活下降了 63.4%;浓度为0. 4 mmol/ L可100%抑制酶活。而硫脲对石榴PPO活性的抑制作用不明显，当浓度达到0. 8mmo1/ L时，抑制率仅为9. 76%。 方法7：抑制剂为气调包装取出预冷后的莲藕，洗净去皮，切分为0. 5cm左右 的薄片，立即进行气调包装。包装气体按不同的初始气体比例分为第一组5%O2+15%CO： +80%N，第二组 15%O,+5%CO,+80%N，第三组 10%O+10%CO?+80%N，第四组 20% O,+60%CO,+20%N，第五组100%O，第六组100%CO,，第七组100%N,。为了进行分析 比较，第八组采

18、用空气包装作为对照组。每组包装七个样品，每个样品重约200G。包装后 立刻转移至4C、相对湿度为85%左右的恒温培养箱中贮藏。预期结果：鲜切莲藕多酚氧化酶活性随贮藏时间的延长呈现不同的变化趋势。第四、六、 七及对照组的多酚氧化酶活性在第68d达到最高后呈现下降趋势，而第一、二、三、五组 的多酚氧化酶活性呈现缓慢上升趋势。方法8：分别配制0.15 G / ml的异Vc钠溶液，0.2 G /L的CACl2，0.15 G /L的 半胱氨酸溶液，0.15 G/L的柠檬酸溶液，0.15 G/L EDTA溶液及0.3 mG / m l的莲藕PPO 溶液，混合后测定酶活性。预期结果：异Vc钠对莲藕PPO有较

19、强的抑制作用，抑制率为96. 2%，其次为半胱氨 酸、氯化钙、柠檬酸，EDTA的抑制效果最低。方法9：将已经切片的莲藕放入2%NACl+0.2%NA2S03溶液，护色l0min，然后取 出清洗干表面水分；选择EDTA(A)、Vc (B)草酸(C)、半胱氨酸(D)和处理时间(E)为参试 囚子，采用L16(45正交试验方案，如图：叱 1_ 7T S JI I. J-_- T L L L F文因素 TOC o 1-5 h z 二评脸如饱 草酸的 半睛质酸 时枇ini D) 分号 A JI C俄hDK J HYPERLINK l bookmark94 o Current Document 血 J.lI

20、:*422424I 75242I 心预期结果：如下图，随着贮藏时间的延长，鲜切莲藕多酚氧化酶活性在贮藏期的前期呈上升趋势，并在第9天达到峰值，其后活性又逐渐下降。2.5 -* 处屋 I F-处理 II III03 ft 0 IJ 15 IE 21四、论文详细工作进度和安排2010.11.22学生选题2010.11.26布置论文任务2010.11.282011.3.15熟悉实验室环境和基本实验操作，准备论文实验所需基本材料2010.12.15完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译2011.3.15前在学校指定时间完成开题答辩2011.3.152011.5.12 实验2011.5.17完成并提交毕业论文2011.5.31在学校指定时间进行毕业论文答辩2011.6.5完成并提交答辩后的修改论文五、主要参考文献潘永贵，陈维信.鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化.食品与生物技术学报,2008,27(2):55-59姚显伟，郭祯祥，马洪娟，张杏丽.在线粉流中小麦多酚氧化酶活性分析.粮食与饲料工业，2010, (5)： 4-6张晓,田纪春.不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较.山东农业人学学报(自然科学版)，2008，39( 1): 15- 18张燕，何晖,吴国良.核桃组织培养中外植体褐变