改进的18Ｏ同位素标记法标记蛋白质多肽

1、革新的18同位素标识表记标帜法标识表记标帜卵白质多肽【摘要】针对18同位素标识表记标帜反响两个紧张影响因素肽段疏散度和胰酶灭活要领，举行了标识表记标帜条件的革新和灭活要领的优化。在h218中参加rapigesttsf助溶剂并微波帮助加热，使-酪卵白胰酶酶切肽段的标识表记标帜服从得到显着革新18/16峰面积比值99%。标识表记标帜后，对胰酶举行复原烷基化化学修饰彻底灭活，使标识表记标帜后的肽段不变性明显进步，安排6d不产生回交反响。对尺度卵白质甲状腺球卵白酶切肽段混淆物标识表记标帜后的质谱实行结果表白：优化的标识表记标帜要领能快速不变地标识表记标帜卵白质酶切多肽。【关键词】18同位素标识表记标帜

2、；多肽；卵白质组peptidelabelingithiprved18inrpratinethdzhayan，luzhuang，jiaei，yingan-a，qianxia-hng*(statekeylabfprteis，beijingprteeresearhenter，beijing102206(beijinginstitutefradiatinediine，beijing100850)abstratinrdertptiizethe18labelingethd，tkeyaspets，peptidedispersinandtrypsindeativatineredisussed。theaddit

3、infrapigesttsfinh218andiraveheatingenhanedlabelingeffiienyf-aseindigestedpeptides(18/16rati99%).heialdifiatinithtris(2-arbxyethyl)phsphine(tep)andidaetaide(iaa)resultedintrypsindeativatedpletely.nsignifiantbak-exhangefr18t16asbservedafterlabelingin6days.theexperientresultithpeptideixturefrshedthatth

4、eiprvedethduldbeeffetivelyusedtlabelprteinandpeptide.keyrds18stableistpelabeling；peptide；prtee1弁言定量卵白质组学通过批量不雅察正常与疾病细胞或构造在卵白质表达谱上的差异，从团体程度上范围化挑选和掘客与疾病相干的卵白，为致病机理研究和临床应用提供紧张参考信息。18同位素标识表记标帜技能是定量卵白质组的一种常用技能15。卵白质酶切后的肽段，在胰卵白酶的催化下，-末了的两个16原子被更换成18原子，从而使质谱检测产生4da的质量差异。通过比力标识表记标帜肽段和未标识表记标帜肽段的峰面积强度，得到一对卵白样

5、本的相对定量干系。只管该标识表记标帜反响具有条件暖和，标识表记标帜前后肽段的理化性子不产生改变，能和肽段的别的疏散阐发要领兼容等长处，但却由于反响条件极难操纵，反响后标识表记标帜产物不不变而影响其在实行室的普及应用。本研究基于18同位素的标识表记标帜原理，讨论了肽段疏散度和胰酶灭活两个紧张因素对标识表记标帜的影响，并据此对要领举行了优化。比拟文献6接纳的水浴孵育标识表记标帜和沸水加热灭活技能，本要领标识表记标帜时间短，标识表记标帜服从强，按捺回交反响。实行结果表现，即便对付庞大的多肽混淆物体系，接纳本要领也能得到高效的标识表记标帜结果18/16峰面积比值99%。2实行部门2.1仪器与试剂480

6、0基质帮助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪aldi-tf-tfs，美国appliedbisystes公司。2.2卵白酶切牛甲状腺球卵白和-酪卵白卵白用20l/lnh4h3溶解后，参加rapigesttsf终浓度0.1%和tep终浓度5l/l，在56复原1h，再参加iaa终浓度25l/l，安排暗处复原1h。参加胰酶-底物150，/的trypsin酶切留宿。2.3卵白标识表记标帜和胰酶的灭活将酶切后的肽段溶液冷冻枯燥后直接参加h218重溶，混匀后放入微波中反响10in。参加tep终浓度100l/l灭活，37水浴孵育1h后，微波反响10in。再参加iaa终浓度100l/l，于暗处安排1h。2.4质谱阐

7、发基质接纳ha。仪器操纵软件为4800explrersftare，数据处置惩罚软件为gpsexplrersftare2.0。一级质谱数据网罗利用s-1kv反射形式，加快电压20kv，扫描范畴/z7003500，激光能量4500，每张谱图累加1500次。马心肌红卵白胰酶酶切肽段作为尺度物对仪器举行外标校正，校准至偏向0.1da，相对尺度缺点10。3结果与讨论3.1加强卵白质酶切肽段的标识表记标帜服从卵白质酶切肽段18标识表记标帜要领的原理是基于胰卵白酶催化产生的两次酶-肽段复合物水解反响。该反响是快速的动态可逆反响。因此，常常产生标识表记标帜服从不完全和标识表记标帜肽段产生回交的环境，有用地操纵

8、标识表记标帜和回交按捺这两个环节是实行乐成的关键7，。本实行通过改进肽段在反响体系中的疏散程度和帮助加热，增长反响服从来有用地进步标识表记标帜服从。肽段在体系中的疏散程度增高后，有利于肽段端的完全表露，增长与胰酶和h218的打仗时机。因此，改进肽段疏散程度，能推进标识表记标帜向正反响标的目的举行。在实行中，参加rapigesttsf助溶剂，能加强卵白质及多肽的溶解性，进步疏散程度，有利于h218举行末了羧基的互换反响。在-酪卵白酶切肽段18标识表记标帜产物质谱阐发结果中，由于参加rapigesttsf助溶剂，/z1660，1267和2316的肽段的标识表记标帜服从显着进步图1a和图1d。而未参

9、加助溶剂组的3个肽段那么标识表记标帜不完全，仍旧存在大量未标识表记标帜的16肽段图1。图1-酪卵白酶切肽段18标识表记标帜前后aldi-tf-tf-s质谱图略fig.1aldi-tf-tf-sspetruftryptidigestedpeptidesf-aseina.未标识表记标帜的-asein酶切肽段质谱图(spetrufunlabeledpeptideixture)；b./z1267，1660和2316的肽段标识表记标帜前质谱图(spetrufunlabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316)；./z1267，1660和2316的肽段未加rapigesttsf

10、，孵育留宿标识表记标帜后的质谱图(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithutrapigesttsf，at37fr24h)；d./z1267，1660和2316的肽段参加rapigesttsf，孵育留宿标识表记标帜后的质谱图(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithrapigesttsf，at37fr24h)；e.质荷比为1267，1660和2316的肽段参加rapigesttsf，微波加热10in标识表记标帜的质谱图(spetruflabeledpeptidesith/zf1267,1

11、660and2316ithrapigesttsfandiraveheatingfr10in)。通例要领中，18标识表记标帜必要在37水浴中孵育24h,以到达充实反响的目的。但即便云云，暖和的反响条件和较长的反响时间也难以包管标识表记标帜完全。卵白质酶切加上标识表记标帜所泯灭的时间凌驾36h，滞后了实行的历程。而且由于长时间置于水浴环境，轻易由于密封不严等环境引入h216，从而导致标识表记标帜不完全。本实行接纳微波加热的方法，不但阻遏了潮湿的环境，而且只必要10in即可标识表记标帜完全。质谱结果见图1d和图1e。与传统的水浴加热要领比拟，由于微波使肽段的受热更为快速和匀称，因此能在很短时间内到达

12、抱负的标识表记标帜结果。3.2标识表记标帜肽段回交的按捺18标识表记标帜反响的另一个常见题目是标识表记标帜肽段轻易产生回交。由于该标识表记标帜反响是一种可逆反响，因此假设将18标识表记标帜完全的肽段溶于h216中，仍能使18标识表记标帜肽段复兴到16标识表记标帜状态。胰酶是造成回交的重要因素，如今文献报道按捺回交的要拥有酸中断法、超滤胰酶法和微波胰酶灭活法，都不克不及完全按捺胰酶的活性，置于h216中仍能产生必然程度的回交7。本研究接纳化学灭活法，通过高浓度的复原试剂和烷基化试剂，对溶液中残留的胰酶彻底灭活。如图2所示，胰酶灭活后，18标识表记标帜肽段在液相色谱活动相2%乙腈-98%水-0.5

13、%甲酸中保存6d仍没有不雅察到显着的回交产物，不变的标识表记标帜肽段能在液相色谱中举行后续疏散阐发。图218标识表记标帜后的-酪卵白酶切肽段在2%乙腈-98%水-含0.5%甲酸溶液中不变性观察略fig.2stabilityflabeled-aseinpeptidesin2%an-98%ater-0.5%friaid(fa)slutina-酪卵白酶切肽段标识表记标帜后aldi-tf-tf质谱图(aldi-tf-tf-sspetruflabeled-asein)；-asein酶切肽段/z1267，1660和2316标识表记标帜后的aldi-tf-tf质谱图(afterlabelingaldi-tf

14、-tf-sspetruflabeled-aseinpeptides/z1267，1660and2316):b.0d；.1d；d.3d；e.6d。3.3庞大肽段混淆物标识表记标帜结果牛甲状腺卵白分子量为660kda。酶切后aldi-tf-tf质谱能检测到此中24条肽段。将优化后的要领用于该卵白质酶切肽段的标识表记标帜，以观察要领在庞大肽段混淆物中应用的有用性和耐受性。结果如图3所示，本要领对付庞大肽段混淆物仍能产生令人满意的标识表记标帜服从。图3牛甲状腺球卵白酶切肽段18标识表记标帜服从图标识表记标帜服从盘算用18标识表记标帜肽段的单同位本质谱峰面积与16肽段的单同位素峰面积比值略fig.3la

15、belingeffiienyfthyrglbinpeptidesith18(18inrpratineffiienyasalulatedby18/16ratifthefirstistpipeakarea)小结18标识表记标帜反响是定量卵白质组学中应用最为普及的同位素标识表记标帜要领之一。但由于该反响是一种动态可逆反响，18互换受到多种因素影响，标识表记标帜服从和按捺回交不停是实行历程中的棘手题目，如今仍不克不及不变地在多个实行室普及应用9，。本研究在标识表记标帜和按捺回交两个关键点上对18标识表记标帜要领举行了优化。通过加强肽段的疏散度，改变帮助加热方法，结合化学要领彻底灭活胰酶，阻断回交反响的产