细胞凋亡实验

1、关于细胞凋亡实验第一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。一、细胞的死亡方式第二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月二、细胞坏死与凋亡的比较 坏死 凋亡 性质病理性、非特异性生理性或病理性，特异性 诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生 生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗能 DNA电泳 形态变化弥散性降解，电泳呈均一DNA片状细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀DNA

2、片段化（180200 bp），电泳呈“梯”状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩 炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应 凋亡小体无有 基因调控无有第三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月三、细胞凋亡的生理意义1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡第四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化凋亡小体 初期：核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小中期：胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割后期：邻近的上皮细胞、M、瘤细

3、胞等吞噬凋亡小体四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变第五张，PPT共二十七页，创作于2022年6月Normal Cell Apoptotic cell 第六张，PPT共二十七页，创作于2022年6月（二）、生化改变 、DNA片段化主要特征 2、内源性核酸内切酶（nase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活第七张，PPT共二十七页，创作于2022年6月 内源性核酸内切酶的作用H1核心颗粒连接区180-200 bp内源性核酸内切酶Zn2+Ca2+ Mg2+第八张，PPT共二十七页，创作于2022年6月五、细胞凋亡的检测方法1、形态学检测（一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞

4、核染色质聚集成团块状）（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察 第九张，PPT共二十七页，创作于2022年6月透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 第十张，PPT共二十七页，创作于2022年6月荧光显微镜 期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(

5、图1）第十一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月2、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300 kbp长的DNA大片段, 或180200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形

6、成第十二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月第十三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月3、流式细胞仪检测 flow cytometer（一）PI 单染 （二）Annexin/ PI双染色第十四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月（一） PI 单染 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS

7、洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。 第十五张，PPT共二十七页，创作于2022年6月判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死） AB第十六张，PPT共二十七页，创作于2022年6月（二）Annexin/PI双染色 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexin是一种Ca2依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。 PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细

8、胞膜完整性受到破坏, 可用PI区分。 第十七张，PPT共二十七页，创作于2022年6月检测标准：早期凋亡细胞：Annexin -FITC (+)；PI (-)；坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞： Annexin -FITC (+)；PI (+)；机械性坏死及非特异性染色： Annexin -FITC (-)；PI (+)；正常细胞：Annexin -FITC (-)；PI (-)； 第十八张，PPT共二十七页，创作于2022年6月C-myc ASO200 nmol/L 凋亡结果坏死结果第十九张，PPT共二十七页，创作于2022年6月4、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多

9、种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。第二十张，PPT共二十七页，创作于2022年6月亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）. JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（）具有

10、极性，JC-1依赖于的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体）和绿色荧光（527 nm，胞液）. 而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590 nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527 nm）. 因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红. 第二十一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红. 第二十二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月5、Caspase-3活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中ca

11、spase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。第二十三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月Western blot 分析caspase-3的活化Caspase 3，6，7Caspase-3正常以酶原(32KD)活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成第二十四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解