生物物理学作业-lc3b蛋白依赖性免疫

1、Reporter: Rui ZhangDate: Nov.5,2015一、背景二、实验思路三、结论背景关于RSV感染病STAT信号通路实验思路1.LC3b-/-缺失加重RSV诱发的IL-17a依赖性肺炎12.RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 对自噬、固有细胞因子 的产生与 CD4+T细胞诱导发生了改变23. LC3b 蛋白的缺失导致Th17相关的RSV诱发的肺炎加重是 通过上皮细胞分泌的IL-1介导图4a-g4.ER压力的改变，导致缺失LC3b的小鼠支气管上皮细胞加 重炎症和细胞因子的产生图5a-g5.在LC3b-/-小鼠中 阻断IL-1受体信号可以减缓IL-17a相关疾病图6a

2、-e实验思路1-1. LC3b-/-缺失加重RSV诱发的IL-17a依赖性肺炎图1a-h1-2. 确定在LC3b-/-小鼠中是否为CD4+T细胞主要分泌 IL-17图1i-j1-3. 检测是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中诱发的肺炎是 IL-17依赖性的图2a-e 1.在RSV诱发的IL-17a依赖性肺炎中，若LC3b-/-缺失，小鼠的 病情将更加严重 特征： 支气管上皮细胞脱落 粘液分泌过多 中性粒细胞增多Figure 1 LC3b-/-缺失的小鼠将加重由RSV诱发的肺炎a 对肺切片进行H & E,H & PAS染色b 与粘液相关的muc5ac与gob5转录本增多（qPCR）qPCRc

3、RSV病毒转录本增多（qPCR）用RSV感染WT与LC3b-/-8天后，d 中性粒细胞增多（流式）e IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay）f IFN转录本减少（qPCR）1a用RSV感染WT与LC3b-/-8天后，3ag 用RSV感染WT与LC3b-/-8天后，IL-1与IL-6蛋白含量上升（使用Bioplex assay）h 用RSV感染WT与LC3b-/- 48h后， IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay）1-2 1-2.确定在LC3b-/-小鼠中哪种细胞类型增强了IL-17的分泌水平 最近对IL-17依赖性疾病模型的研究表明，在IL-1受体信号通路中-T

4、细胞受体阳性细胞与固有淋巴细胞产生了大量的IL-17a蛋白。i 检测肺中CD4+T细胞，CD3+T细胞与ILC3s细胞的数量（流式）j 检测纵膈淋巴结（MedLNs)中CD4+T细胞，CD3+T细胞的数量1-21-3.检测是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中诱发的肺炎是IL-17依赖性的 之前我们实验室的研究发现在RSV感染后，本由IL-17a导致的肺炎，过多的粘液分泌与IFN分泌的抑制也被CD8+T细胞诱导。Figure 2 用IL-17a抗体中和证明在RSV感染的LC3b-/-小鼠中诱发的肺炎是IL-17依赖性的a RSV感染8天后，肺组织切片进行H & E,H & PAS染色，表明加入

5、IL-17a抗体后，炎症减弱b 由抗体中和后，与粘液相关的muc5ac转录本减少（qPCR）c 由抗体中和后，中性粒细胞增多（流式） d 由抗体中和后，RSV病毒转录本减少（qPCR）e 由抗体中和后，IFN转录本增加（qPCR）2实验思路2-1. RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 对自噬、固有细胞 因子的产生与 CD4+T细胞诱导发生了改变图3a-f2-2. RSV感染后，确定是否DCs优先诱导CD4+T细胞分泌 IL-17a图3j2-3. 进一步确定LC3b-/-DCs 诱导CD4+T细胞分泌IL-17a 是自噬缺失的结果图3h-i 2-1.RSV感染后，自噬与固有细胞因子的

6、产生发生了改变，由 LC3b-/-CD11+ DCs对 CD4+T细胞诱导也发生了改变 研究表明在Th17免疫反应中需要CD11chigh CD11b+组织驻留DCs细胞，自噬的改变导致DCs与巨噬细胞接收TLR竞争者信号分泌IL-23DC细胞对炎症的两种反应途径Figure 3 RSV感染后，自噬与固有细胞因子的产生改变，由 LC3b-/- CD11+ DCs对 CD4+T细胞诱导产生IL-17改变a LC3b-/- 小鼠与自噬相关的炎症小体明显降解（荧光染色，共聚焦显微镜观察 结论b 8h后，LC3b-/-p62保持积累（western分析）c IL-1，IL-6明显上升 （流式分析）d

7、感染24h后，IL-12的亚基p35与p40明显减少，IL-23明显上升（流式） e IL-1与IL-6上升（使用Bioplex assay）f 感染24h后，IL-12的亚基p35与p40转录本明显减少2-2g IL-17a升高（使用Bioplex assay）h 用OVA与RSV共处理，LC3b-/-DCs产生更高的 IL-17ai 用OVA与RSV共处理，LC3b-/-CD11b+DCs产生更高 的IL-17a4 3. LC3b 蛋白的缺失导致Th17相关的RSV诱发的肺炎加重是通过上皮细胞分泌的IL-1介导 由于上皮细胞中分泌的LC3b是一种重要的肺炎调节器，检测结构与骨髓干细胞在RS

8、V诱导的肺炎中的作用Figure 4 结构与骨髓干细胞LC3b的缺乏都会加重RSV诱发的肺炎a-c 说明嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠细胞炎症最严重，中性粒细胞与IL-17a蛋白分泌最多d RSV体外再刺激MedLN（纵膈淋巴结）48h后，IL-17a含量升高e 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠细胞分泌的IFN最少f LC3b-/-型小鼠IL-6明显分泌增多g 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠细胞分泌的IL-1最多 4.ER压力的改变，导致缺失LC3b的支气管上皮细胞加重了炎症和细胞因子的产生 进一步检测在RSV感染中参与的先天性细胞因子。Figure 5 在RSV感染后由LC3b-/-型气

9、管上皮细胞与肺巨噬细胞产生的促炎细胞因子增加a 免疫组化分析说明IL-1是由上皮细胞产生的（IL-1抗体与E-Cadherin抗体处理）b IL-1与IL-1转录本升高c IL-1与IL-6含量上升（使用Bioplex assay）d 含肺巨噬细胞IL-1细胞数量上升（流式分析）e ER压力相关基因CHOP,Edem-1 与cleaved XBP-1 (XBP-1s)的转录水平升高f 加入IRE-1a（ER压力传感器蛋白）抑制剂DBSA，IL-1与IL-6减少（使用Bioplex assay）g 与IL-1剪切有关的Caspase-1的p10亚基的检测，加入DBSA后明显减少45.在LC3b-/-小鼠中 阻断IL-1受体信号可以减缓IL-17a相关疾病 LC3b-/- 小鼠中，检测IL-1的过表达是否为促Th17分泌的原因。Figure 6 RSV感染后 LC3b-/-小鼠后，由于IL-1受体信号的阻断，加重的IL-17a依赖性肺炎减轻 a IL-1Ra（IL-1受体拮抗剂）处理后，肺组织切片进行H & E,H & PAS染色， 炎症明显减轻 IL-1Ra（IL-1受