山东省高等学校科技计划项目申书

1、山东省高等学校科技计划项目申请书（A）学科名称：中药学学科代码：1008项目名称：花紫珠抗单纯疱疹的物质基础研究项目：所在学校：山东中大学填表日期：2015-02-26山东省教育厅制项目类别研究类别编 号BA填表说明1.申请书为山东省高等学校科技计划项目的主要文件，是评审、立项和签订合同书的依据。各项内容须认真填写，表内栏目不能空缺，无此项内容时填“/”。2.填写申请书前，请认真查阅山东省高等学校科技计划管理办法。申请书各项内容应实事求是，表达要明确、严谨。外来语要同时用原文和中文表达，第一次出现的缩写词，须注出全称。“项目名称”（中文）要准确、简明、具体，字数（含符号）不得超过 30 个汉字

2、。3“学科名称” 和“学科代码”请按照学位授予与培养学科目录（2005 年 12月更新版）填写，封面上填写该项目所属的一级学科及代码，项目基本信息表中填写该项目所属二级学科及代码。4.封面右上角的“项目类别”和“研究类别”与项目基本信息表相同。5.“计划”指获得以上计划资助者。6.申请书及附件等材料均用 A4 纸双面打印，左侧装订，封面装订为纸质。一、项目基本信息项目概况项目名称花紫珠抗单纯性疱疹的物质基础研究项目类别B资助经费项目自筹经费项目研究类别A基础研究应用研究申请经费万元学科名称中药学学科代码100800起止年限2015 年 7 月 至2017 年 6 月项目负责人姓 名男出生年月1

3、984.12证 位博士学位授予时间2012.7讲师计划/所在科技创新国家新药研发大（山东）-中药创新药物研究单元技术山东省高等学校中抗协同创新中心所在学校名称山东中大学所在院系药学院合作一/合作二/项目组情况总人数其中：教师情况其中：学生情况合 作数高级中级初级博士生生933/21/主要参加人员姓 名职 称号工作项目分工签 名教授山东中大学成分鉴定山东中大学学研究山东中大学提取分离崔讲师山东中大学提取分离讲师山东中大学配比研究博士生山东中大学学实验博士生山东中大学学实验生山东中大学提取分离主要研究内容及 技术经济指标（限 200 字）课题组在山东省高等学

4、校中抗协同创新中心的支持下完成了 花紫珠的抗谱研究，发现花紫珠具有较强的抗单纯疱疹（HSV-）活性。本研究在此基础上从 花紫珠的不同极性部位入 手，运用体外方法进行活性导向分离，定向筛选 花紫珠中抗 HSV-的活性部位，逐级筛选抗 HSV-的活性物质，追踪分离至有效组分或成分，对成分进行结构鉴定；在此基础上进行配比研究，阐释 花紫珠抗HSV-的物质基础。23 篇，申请发明专利 1 项。词（不超过 3 个）花紫珠；单纯性疱疹；物质基础；二、立项依据（包括项目研究意义，国内外研究现状、水平和发展趋势，并附主要参考文献）频发成为人类健命与社会安全的问题。迄今为止，全世界发现的引起的疾病多具有传染性强

5、、已经超过 3000 种，其中能使人类致病的有 1200 余种。由高、流行面广及率高等特点，是人类至今尚不能有效控制的世界难题。随着的不断变异，新型性疾病的逐渐呈上升趋势。因此抗成为世界的科学问题。单纯疱疹(Hes Simplex, HSV)属于痗疫科 亚科，为DNA，有 I 型和 II 型 2 种型，人类是其唯一宿主。I 型单纯疱疹(HSV-1)主要面部的皮肤和粘膜，引起疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、口龈炎、咽炎或扁桃体炎和皮肤疱瘆性湿疼等1。据统计，目前人群中 HSV-1型阳性较高，大约为 90%2。HSV-1 具有嗜神经性，能在中枢神经系统中建立潜伏，且在免疫低下等情况下复发。单纯疱疹性脑炎

6、，是 HSV中枢神经系统引起相应的炎性改变，是中枢神经系统最常见的性疾病，研究表明，HSV-1 是常见的中枢神经系逐年增高，在缺乏治疗的情况下可达 70%统病原体，由 HSV-1引起的神经性脑炎的的致死率3，其引起的临床病死率高，预后差，患者常遗留较多的神经功能缺损。流行病学表明性角膜炎以单纯疱疹最为常见，其中 HSV-1 致病率高达 90%以上，是疱疹中，引起眼疾最多的病原体4。该病病程长、反复发作，最终可以导致角膜白斑、角膜新生角膜溃疡甚至穿孔等而严重危害患者的视功能5。目前尚无有效控制复发的药物，其治疗增生、，已6。反复发作后角膜混浊逐渐加重，最终导致失明。HSV-1病等的发生发展密切相

7、关，也是HIV 并发的主要病原体7。成为眼科最棘手性疾病如与神经退行HSV 的分为裂解染期和潜伏期。当机体后会在部位快速发生裂解性，另外，部分沿轴突上行至神经节并建立潜伏，其在潜伏期不进行组的，检测不到蛋白的表达，只能检测到低拷贝的 DNA 和潜伏相关的 RNA 转录本从而能够避幵宿主免疫系统的识别。当受到外界压力或者机体免疫功能下降时，会被再次激活发生裂解染，导致复发8。HSV 潜伏的隐蔽性也导致了防治 HSV的研发，目前临床没有可用于防治 HSV的有效。目前临床常用的治疗药物主要是无环鸟苷等核苷类及其类似物，如靶点是韦、伐昔洛韦、更昔洛韦等，以及以焦磷酸钠为代表的非核苷类似物，他们的作用的

8、9。核苷类似物具有诱变性，安全性低，并且在上世纪DNA 聚合酶，抑制80 年代 ACV 耐药株即已出现，而且随着抗疱疹药物的广泛使用，关于耐药株的也越来越多10，因此寻找作用靶点不同于药物研究显得十分重要。韦等核苷类似物、毒副作用小、安全可靠、廉价的抗HSV在病的防治方面具有独特的优势，现代临床与药理药效研究发现夏至草11、灵芝12、中黄精13、藜芦14、大黄15、芍药16、栀子17和鱼腥草18及其提取物均显示出了抗 HSV 活性，其作用机制包括了抑制和侵染细胞、提高抗免疫活性、以及调节宿主细胞炎性因子和等，充分体现了中药治疗疾病的多组分、多治疗靶点特点和优势。以中医理论为指导，结合现代科学技

9、术，基于单味中药或其复方，以中医临床实践作药效基础，从中筛选、发现及研制具有药效物质明确、作用机制清晰、安全高效等特点的抗权，而且符合中药现代化的需要，具有显著的国际竞争力。创新药物，不仅具有知识产花紫珠为马鞭草属植物 花紫珠 Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.的地上干燥部分，曾收载于中国药典1977 版一部，是海南黎族医生常用药材之一19。唐代陈藏器的本草拾遗记载“紫珠：味苦、寒，无毒，解诸毒物，痈疽，飞尸，盅毒，毒肿，下瘘，蛇，狂犬”。花紫珠功效消炎，解毒，收敛，止血，临床用于细菌引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸道20。现代药理研究证明 花紫珠主要具有止血

10、21、抗炎22、抑菌23、增强免疫24等和消化道活性。使用 花紫珠分散片联合韦治疗带状疱疹，其有效率显著高于单独使用。课题组已经对 花紫珠的抗 HSV 活性和物质基础进行了初步研究， 花紫珠的水提取液和乙醇提取液均显示了抗 HSV 活性。采用 花紫珠治疗 HSV 引起的疾病，可以充分发挥多成分的协同作用，所以 花紫珠不失为一种极具市场潜力的防治 HSV 的物质来源。本研究在已有工作基础上，从 花紫珠的不同极性部位入手，运用体外方法进行活性导向分离，定向筛选 花紫珠中抗 HSV 的活性部位，在此基础上，逐级筛选抗 HSV 的活性物质，追踪分离至有效成分。对成分进行结构鉴定，在此基础上进行配比研究

11、，为将其在抗HSV 方面的应用或发现新的先导化合物奠定基础。该研究的顺利实施不仅具有重要科学意义和应用价值，而且可减少国家卫生总费用支出，对于 HSV 所引起的相关疾病治疗有着较大现实意义。参考文献：1. Ryan, K.J. and Ray, C.G., Sherds Medical Microbiology. 4th ed. 2004: McGraw Hill.2. Chayavichitsilp, P., Buckwalter, J.V., Krakowski, A.C., et al, H2009. 30(4): 119-130.es Simplex. Pediatrics in Re

12、view,3.Whitley R.J. H71(2-3): 141-8.es simplex encephalitis: adolescents and adults. Antiviral Res, 2006,4.5.6.,.单纯疱疹性角膜炎的研究新进展J。国际眼科杂志, 2011,11（3）: 439-441. 单纯疱疹主编. 眼科学.性角膜炎.: 人民卫生: 人民卫生, 2005:184-6.2005: 1220-4.7. Wang, H., Reilly, K.H., Smith, M.K., et al .,Hes simplextype 2 incidence and assoted

13、 riskfactors among female sex workers in a high HIV-prevalence area of China,& AIDS, 2013. 24(6): 441-446.ernational Journal of STD8.Jenkins, F.J. and Turner, S.L., H1996. 1: d241-247.es simplex: a tool for neuroscientists. Frontiers in Bioscience,9. Taylor M.P., Koyuncu O.O., Enquist L.W. SubverNat

14、 Rev, 2011, 9: 427-439.of the action cytoskeleton during viralinfection.10. Roberts K.L., Baines J.D. Action in hesinfection.es, 2011, 3: 336-346.作用研究J. 山东中医杂志, 2014,11., 等.夏至草体外抗单纯疱疹33(11):928931.12 Liu J,F, Meng Y, et al.sible mode of action of anti hetic activities of a proteoglycanisolated from

15、the mycelia of Ganoderma lucidum in vitro. J Ethnopharmaeol,2004,9(5):26522721.13. Liu F, Liu Y, Meng Y, e tal. Structure of Polysaccharide from Polygonatum cyrtonema Hua and theantihetic activity of its hydrolyzed fragments . AntiviralRes,2004,6(3):18321891.14.Doeherty JJ, Smith JS, Fu MM, et al. E

16、ffect of topically appd resveratrol on cutaneous hes simplexinfections in hairless mice. Antiviral Res, 2004, 6(l):1922615, 等. 中药大黄抗单纯疮疹作用的实验研究J.中华传染病杂志,1991(3):160163.卢长安,. 芍药提取物 CY 对豚鼠皮肤疙疹的作用J.中草药,1994, 25(12):635642. 桅子提取物T9、TH 抗单纯疱疹型作用机理研究D.2007. 天然产物抗单纯疱疹活性评价及机理研究D.大学. 2014. 19. 黎药学概论 M.: 人民卫生,

17、 2008: 165-197.中民药品标准中药成方制剂(第六册)P. 标准：WS3-B-1261-92。, 冯 峰, 等.花紫珠的化学成分及其止血活性研究J. 中国中药杂志, 2010, 35(24):3297-3301., 徐 凯, 李留法, 等.花紫珠总黄酮的抗炎、止血作用研究J. 现代中西医结合杂志, 2009, 18(26): 3161-3162.,轶, 王世雄.花紫珠片的抗茵消炎和止血作用研究J. 海南大学学报: 自然科学版, 2002, 20(2): 154-157.,才.花紫珠抗炎作用及增强免疫功能的实验研究J.微量元素科学,2006, 13(8):39-41.三、研究目标、研究

18、内容和拟解决的关键问题1、研究目标 以 花紫珠为对象，运用体外抗 HSV 筛选模型，在等剂量不等强度原则下活性导向分离，获得至有效组分或有效成分，并进行结构鉴定，从中寻找具有重要价值的活性成分或先导化合物。 采用正交设计或均匀设计对获得的 花紫珠有效组分或有效成分抗HSV 的最佳配比，为抗 HSV新药研究提供基础。2、研究内容 花紫珠体外抗HSV 的活性物质追踪以 HSV 己经长成单层的 Hep-2 细胞，建 外HSV 宿主细胞模型，采用系统溶剂法提取制样，利用敲除法,进行倍比筛选，逐级筛选抗 HSV 的活性物质，追踪分离至有效组分或有效成分。 花紫珠抗 HSV 有效组分或有效成分的配比研究采

19、用正交设计或均匀设计对获得的有效组分或有效成分配比筛选，每个分别设立零、中、高三个水平，对其进行体外评价，获得的 花紫珠有效组分或有效成分抗HSV 的最佳配比。3、拟解决的关键问题 寻找并鉴定 花紫珠抗 HSV 有效组分或有效成分，为拟解决的关键问题之一。 确定 花紫珠有效组分或有效成分抗 HSV 的最佳配比为拟解决的关键问题之二。四、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1、研究方案花紫珠体外抗 HSV 筛选模型建立 细胞的复苏及培养HSV 冻存管从液氮罐取出，立即投入 3742温水中融化（遵循慢冻速溶原则），超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，1000 rpm，5 min，弃冻存液，

20、加入 8ml 浓度 10 %的 1640 细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在 37、5%CO2 恒温培养箱中培养，待细胞长成单层后进行传代。 的扩增将 HSV 接种于己经长成单层的 Hep-2 细胞上，加 1640 维持液 8 mL 置 37、5% CO2培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现 80%以上的病变时，反复冻融 3 次，用吸管轻轻吹打，1000 rpm，5 min，取上清液定量分装于 瓶中，胶布 ，放于-80冰箱冻存备用。 毒力的测定将 用 1640 维持液做 10 倍比系列稀释不同浓度，纵向重复 4 孔，依次接种于己长成单层的 Hep-2

21、细胞的 96 中，同时设细胞对照。37、5% CO2培养箱中培养，倒置显微镜下逐日观察，连续观察 5 d，将板 液体吸弃，加 1%中性红 50L，37、5 %CO2 培养箱中 1 小时，弃染液，用洗液将多余 充分洗漆，加脱色液 100L，室温脱色 l0 min，用酶标仪在 540 nm 波长测定 OD 值。根据 Reed -Muench 公式计算 液的半数 浓度TCID50。细胞存活率=各组OD 值/正常细胞OD 值*100%细胞病变率=1-细胞存活率细胞比距=(高于 50%病变率-50%) / (高于 50%病变率-低于 50%病变率)*100%TCID50=Antilg (Ig 高于 50

22、%CPE 百分率稀释度+比距*稀释因子对数)药物对细胞毒性测定将药物用 1640 维持液按二倍比稀释 10 个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的 Hep-2 细胞的中，并设 4 个复孔及细胞对照孔；37、5%CO2 培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续96观察 3 d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，中性红染色，用酶标仪在 540nm 波长测定 OD 值，应用 Reed-Muench 公式计算药物半数(TC0)。浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度TC50=Antilog (log 高于 50%CPE 百分率稀释度+比距)*C 药物抗 HSV 实验药物从无毒浓度起用 164

23、0 二倍比系列稀释 10 个浓度，每孔 50L 接种于已长成单层 Hep-2 细胞的 96 板孔中，每孔再加入 50L HSV 液，同时设林阳性对照组、对照组及空白细胞对照组，每组 4 个复孔。5% CO2 培养箱中培养，观察细胞病变，待对照出现 90%以上的病变时，1%中性红染色，并用酶标仪在 540 nm 波长测定OD 值。应用 Reed-Muench 方法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。EC50=Antilog (log 高于 50%CPE 百分率稀释度的值-比距)*CTI=半数毒性浓度(TC50) /半数有效浓度(EC50) 数据处理用统计SPSS17.0 进行数据

24、统计 花紫珠抗 HSV 有效部位活性确认称取干燥的 花紫珠适量，分别用 8 倍量 95%、75%乙醇和水热回流提取 1 次，每次 2 小时，过滤后合并提取液，减压浓缩至无醇味。浓缩液减压干燥，成极细粉，分成 4 份。三份分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇超声提取 3 次，合并提取液，提取剩余部分作为敲出相应部位的供试品。利用体外抗 HSV 模型筛选，利用统计进行供试品和原提取物的活性对比，如果活性降低则确定被敲出部位 花紫珠抗 HSV 有效部位。 花紫珠抗 HSV 有效组分或有效成分的分离鉴定使用硅色谱、液相色谱、逆流色谱对上述所得有效部位进行纯化分离，体外活性追踪有效组分、有效成分。对于所得有效

25、组分或有效成分，运用紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱、多维核磁谱进行结构确定，对于结构明确的有效组分或有效成分进行理化性质研究。 花紫珠抗 HSV 有效组分或有效成分的配比研究基于性疾病的耐药性和中药治疗的整体性和协调性的原则，采用正交或均匀设计对获得的有效组分或有效成分配比筛选，每个分别设立零、中、高三个水平，对其进行体外评价，获得花紫珠抗HSV 的有效组分或成分的最佳配比。2、技术路线花紫珠药材3、可行性分析立论依据和基础充分系统提取，减压干燥提取物粉末在以往承担课题研究的基础上，项成员已掌握中药药效物质提取与系统溶剂分离纯化，能熟练从事抗相关的实验研紫珠具有很强的抗 HSV 活性，本研究是

26、以前工作的进一步深入确定其活性部位、组分甚至成分，立论依据和研究基础充分。方案和内容在总体研究思路指导下，在已有文献和前期工作的支持下，已制定了相对详尽的实施方案及研究内容。体外活性筛选配备合理活性部位系统分离，活性筛选活性组分A活性组分N具 敲出石油醚敲出乙酸乙酯敲出正丁醇敲出水溶性部位部位部位部位项目组有教授、 、讲师以及 等组成，专业涉及中药学、药物化学、 微生物以及分子生物学等领域， 学历结构和学缘结构合理涵盖 需领域，具有较强协作能力，可保障研究不紊进行。本研究依托山东省高等学校中 抗 协同创新中心和山东省中药药效物质发现与纯化工程，拥有生物安全二级 和 高效液相色谱仪、高速逆流色谱

27、仪等仪器，可为本项目顺利开展和 完成奠定坚实基础。五、项目创新点花紫珠在临已被用于治疗性疾病，但关于其对单纯疱疹的的作用，物质基础尚未见，故本研究具有原始创新性。 本研究在进行活性追踪时，考虑到各部位的相互作用，采用敲出法进行试验，符合中治疗疾病的整体观，可以比较客观评价各提取部位的活性。六、项目 简历与已具备的研究基础、研究条件简历，1984.12，山东省兰陵县人，2002.9 年至 2012.年 7 月，在山东中 大学学习，分别获得中药学学士、 和博士学位，导师为中药学教授。2007.72009.12 参与国家十一五支撑计划课题“动物中药材全蝎 深加工 研究”，主要参与了全蝎 制工艺研究、

28、全蝎抗肿瘤药效物质的提取纯化工艺和相关的抗肿瘤活性比较试验，申请国家发明专利 1 项； 2008.3-2011.3 月，参与了山东圣旺药业和山东中 大学合作项目“甜菊糖 共性关键术及其循环经济综合开发研究”，主要负责高纯度莱 A 提取纯化工艺研究，使莱 A 的含量从 40%上升到 95%以上，申请发明专利 1 项，并获得山东省科技进步奖二等奖（4/9）；2011.12013.12参与国家 新药创制专项课题治疗老年性痴呆创新中药-醒脑益智胶囊的研制，主要负责药物的提取纯化工艺以及制剂工艺研究；2013.1 至今作为主要 参与国家 专项课题“二至方”有效组分群筛选及其候选新药研究，负责药效物质的提

29、取分离和鉴定；2014.1 至今参与国家 新药创制专项课题 口服液抗 机理研究及其 ，负责 口服液治疗肺 化及抗的药效研究（子任务）；2013 年 1 月至今作为骨干成员参与了山东省高校中抗协同创新中心的建设工作，并承担了中心课题“ 花紫珠抗谱研究”。此外还参与了国家自然基金课题香干预肾病氧化应激损伤作用机制及物质基础研究和活性成分的光酶诱导和生物机制研究。主要承担课题1. 国家 新药创制专项课题： 治疗老年性痴呆创新中药- 醒脑益智胶囊的研制 （2011ZX09102-003-06），240 万，第 5 位，2011.12013.12。2.国家新药创制专项课题：“二至方”有效组分群筛选及其候

30、选新药研究(2013ZX09103002)，120 万，第 3 位，2013.12015.12.3. 国家新药 创制专项 课题 ：口服液 治疗肺化及 抗的药效研究(2014ZX09509-001001002).90.75 万。第 3 位，2014.12016.12.4.国家自然科学基金：香干预肾病氧化应激损伤作用机制及物质基础研究（81274049），70 万，第 7 位，2013.12016.12.5.国家自然科学基金：活性成分的光酶诱导和生物机制研究（81273394），60 万，第 6位，2013.12016.12.获得学术2010，甜菊糖产业共性问题及其循环经济模式研究, 山东省科技进

31、步二等奖，4/9.2、研究基础课题组在山东省高等学校中抗协同中心的支持下完成了花紫珠的抗谱研究，发现其在体外有较强的抗 HSV 活性，并对物质基础进行了初步研究，花紫珠的水提取液和乙醇提取液均显示了抗HSV 活性。水提液 200*醇提液 200*正常对 200*分别用依次用 95%、75%乙醇和水对对照 200*花紫珠进行提取，提取物分别分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇超声提取 3 次，合并提取液，提取剩余部分作为剔除相应部位的供试品。利用体外抗 HSV模型筛选，利用统计进行供试品和原提取物的活性对比，确定 花紫珠抗 HSV 有效部位在乙酸乙酯和正丁醇部位。并对这两个部位的活性进行了验证。正丁醇部位200*乙酸乙酯部位 200*3、研究条件本研究依托山东省高等学校中抗协同创新中心进行相关研究，该中心是山东中大学根据国家防治性疾病的需求，针对目前中抗研发力量分散、薄弱和企业创新能力不强等突出问题，联合山东省医学、泰州市所、中国疾病控制中心所等建立的面向行业的协同创新中心。中心拥有温病理论研究与抗处方发现技术平台、抗中药药效物质提取纯化技术、高通量筛选技术和抗中药药效机制技术平台，下设活性物质靶点机制研究室、抗免疫机制研究室、细胞样本