蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶

1、蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶摘要】目的:从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法:采用离子交换和亲和层析技术进展纯化。结果:从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯,比活可达800u/g以上,远远高于哺乳动物来源的激肽原酶,纯度可达95%以上。对其性质考察,r为38000,n-末端的15个氨基酸序列分析说明,该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶激肽释放酶同源。结论:这种方法合适于工业化消费。【关键词】江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶自从有人在美洲锋芒蝮蛇(bthrpsjararaa)

2、蛇毒中发现激肽原酶后,蛇毒激肽原酶越来越受到广阔学者的重视1。我国蛇类资源丰富,但受提纯工艺的限制,至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们采用离子交换和亲和层析技术,从江浙蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶,并对其性质进展了研究。1材料和方法1.1材料江浙蝮蛇蛇毒冻干粉辽宁省清源县,deae-sepharse,琼脂糖凝胶瑞典pharaia公司,苯甲酰精氨酸乙酯baee,对甲苯磺酰精氨酸甲酯tae,标准蛋白,激肽原,激肽等底物siga公司,低压型高效液相色谱仪日本岛津公司,8823b紫外检测仪北京宾达英创科技,balb/小鼠7周龄由中国药品生物制品检定所

3、实验动物中心提供。1.2方法1.2.1蛇毒激肽原酶的别离纯化1deae-sepharse离子交换色谱:称取江浙蝮蛇毒15g,用0.02l/lph7.8的tris-hl缓冲液溶解,以4000r/in离心20in,取上清,透析12h后,以6.0l/in的流速上阴离子交换柱deae-sepharse,上样完毕后以0.02l/lph7.8的tris-hl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。2亲和色谱法:免疫抗体亲和层析柱的制备:取少量离子交换色谱活性洗脱液,用高效液相色谱法纯化并经定性得到蛇毒激肽原酶,取该蛇毒激肽原酶50g与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物,对7周龄的balb/小鼠皮下注射免疫,每次0.2l,

4、每周1次,共免疫6次。在采集血清前3d取0.2l刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4b-sepharse琼脂糖凝胶,把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上,从而制成免疫亲和层析柱。亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶:将经离子交换纯化的酶用平衡液透析,上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液0.02l/ltris-hl缓冲液,ph7.2,含0.5l/lnal,70g/larg洗脱。搜集洗脱峰,冷冻枯燥保存。3纯度检测:取主峰组分适当稀释,用高效液相色谱hpl法检测。色谱条件:tsk-2000s凝胶柱,280n检测,流速1.0l/in,0.5l/l磷酸盐缓冲液ph7.0为流动

5、相,进样量20l。1.2.2比活性测定舒缓激肽原酶活力测定2:取0.2l激肽原底物20g/l,0.05l/l,ph7.8磷酸缓冲液配制,加0.1l酶液,37水浴保温3in,立即取0.15l测离体豚鼠回肠平滑肌收缩幅度,用0.1g激肽做对照,以每毫升酶液3in释放相当于1g激肽定为1活力单位u。精氨酸酯酶活力的测定:以baee及tae为底物测定3。蛋白含量的测定:采取凯氏定氮法测定蛋白质含量。1.2.3理化性质电泳法相对分子质量r测定:以兔磷酸化酶br97400、牛血清白蛋白r66200、兔肌动蛋白r43000、牛碳酸酐酶r31000、胰蛋白酶抑制剂r20220、鸡蛋清溶菌酶r14400作标准蛋

6、白,用复原型sds聚丙烯酰胺电泳法测定。高效液相色谱分析:色谱条件tsk-2000凝胶柱,280n检测,流速1.0l/in,0.5l/l磷酸盐缓冲液ph7.0为流动相。以牛血清白蛋白第v组份66200、卵清蛋白44300、木瓜蛋白酶r21000、溶菌酶r14300为标准蛋白,测定纯度及r。n-末端氨基酸残基测定:pvdf膜上样,abiprise491型测序仪测定。1.2.4酶学性质最适ph:将baee配于不同ph的0.05l/ltris缓冲液中,测定激肽原酶水解baee的最适ph。不同ph值下的稳定性:将激肽原酶分别溶于不同ph值的0.1l/ltris缓冲液,于室温静置24h后,取样测定水解b

7、aee底物的活性。不同温度下的稳定性:将激肽原酶分别于不同温度下保温3h,测定水解baee的活性。edta对激肽原酶活性的影响:将激肽原酶制成含0.1l/ledta的溶液,测定水解baee活性。不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响:将激肽原酶制成含a2+、zn2+、2+、hg2+、g2+、ba2+0.010.1l/l的溶液,测定其水解baee的活性,并用edta络合后再分别测定其水解baee活性。2结果2.1蛇毒激肽原酶的别离纯化蝮蛇毒经deae-sepharse阴离子交换层析,亲和层析,可将杂质蛋白除去,得到的样品经hpl检验,纯度可达95%以上。图1deae-sepharse离子交换色谱图

8、略透过峰过后,梯度洗脱得到5个峰,经定性检测3,4号峰为活性峰.图2蛇毒激肽原酶亲和色谱图略1:平衡液洗脱透过峰;2:为亲和洗脱液洗脱所得活性峰.图3激肽原酶纯度检验图谱略色谱条件:tsk-2000凝胶柱,280n检测,流速1.0l/in,0.5l/l磷酸盐缓冲液ph7.0为流动相,对峰面积积分,主峰面积达95%以上.图4激肽原酶sds聚丙烯酰胺电泳图谱略:分子量标准品;s:蛇毒激肽原酶样品.2.2活性测定与粗毒相比,提纯高的激肽原酶比活进步了约300倍,活力回收率可达60%以上,水解baee的比活可到达800/g以上,水解tae活性较低,约是水解baee活性的5%。2.3理化性质经sds聚丙

9、烯酰胺电泳及hpl方法检测,江浙蝮蛇毒激肽原酶的r约为38000,与组织型激肽原酶相似。2.4江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列4比拟蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶具有同源性,属丝氨酸蛋白酶的一种,且与哺乳动物的胰蛋白酶激肽释放酶具有同源性。表1江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列比拟略2.5酶学性质最适ph:测定蛇毒激肽原酶水解baee底物活性的最适ph值为7.08.0,这与哺乳动物的组织激肽原酶一样,ph10以上,底物自发水解无法测定。不同ph值下的稳定性:蛇毒激肽原酶在ph4.09.0条件下,活性根本不变,p

10、h低于4.0或高于9.0时,活性迅速下降,ph大于10.0时,底物baee发生水解而无法测定。不同温度下的稳定性:在30以下时,激肽原酶的活力根本不变,超过40时,活力迅速下降,高于60时,发生蛋白质变性而有沉淀析出。edta对激肽原酶活性的影响:edta对激肽原酶的活力无影响,证明蛇毒激肽原酶不是金属酶。不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响:a2+、g2+、ba2+对激肽原酶活力无影响,zn2+0.1l/l、hg2+0.01l/l、2+0.1l/l可完全抑制激肽原酶活性,且用edta络合不能使其活力恢复,蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质,故hg2+可使其活性丧失,但zn2+、2+对其活性影响

11、的原因尚不明确,可能是因为与蛇毒激肽原酶不可逆性结合,从而改变其构象使其失活。3讨论激肽原酶在体内有重要的生理功能5,目前临床广泛用于原性高血压、心绞痛、动脉硬化、视网膜血流障碍、肢端知觉异常,闭塞性血栓性血管炎等疾病的治疗。但因为以往从哺乳动物的胰腺提取的胰激肽原酶纯度不高,具有一定的抗原性,进入人体后,可能诱发过敏抗原抗体反响,已有报导注射胰激肽原酶导致固定性药疹6及重症多形红斑药疹7,且不能实现静脉给药,使药物不能最大限度发挥效用。近年的提取工艺虽可得到高纯度激肽原酶,但在提取过程中,酶活力损失较大,回收率低,难以实现工业化消费,因此寻找高纯度且无抗原性的激肽原酶并建立一套合适工业规模化

12、消费的工艺方法是目前面临的新课题。我们在传统提取工艺的根底上,用离子交换,亲和层析两步即可制备高纯度的蛇毒激肽原酶,该方法设备简单,条件温和,产品回收率高,产量大,完全符合工业化消费的要求,填补了蛇毒激肽原酶消费工艺上的一项空白。与哺乳动物来源的激肽原酶相比,从江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特点:比活高800u/g,r小约为38000,等活力单位给药蛋白含量低,不易引起过敏反响;纯度高,提纯后纯度可达95%以上。假如用于药物,大大进步了药物的平安性;无病毒隐患。不携带可能同人类共同感染的病毒。无酶原形式,不需活化即可释放激肽,可直接发挥作用。该蛇毒激肽原酶最适ph值为7.08.0,且在ph4

13、.09.0范围内,活力根本保持不变,有利于在人血浆环境中保持其活性。该酶在30以下活力根本不变,而在冻干状态下,37放置90d,活力下降在5%以内,经试验,在整个冻干制剂消费过程中,酶活力的损失率均在10%以内,因此可以消费出相对稳定的制剂产品。n-末端的氨基酸测序结果说明,蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶同源,属丝氨酸蛋白酶的一种,可能也具备大多数蛇毒丝氨酸蛋白酶的特性具有较长的生理半衰期,可能成为临床用药;同时,它与哺乳动物的胰蛋白酶激肽释放酶具有同源性,可以局部解释其与组织激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质,不是金属酶,而zn2+、2+对酶活性的影响的机制可能与改变其构象

14、有关,有待进一步证明。总之,我们从蛇毒提取的激肽原酶将为药学领域提供一条新的途径,应用于药物必将带降临床新的治疗方法。【参考文献】1yusefg,diaandisep.anverviefthekallikreingenefailiesinhuansandtherspeies:eergingandidatetuurarkersj.linbihe,2022,36(6):443-452.2王心民,戚正武.浙江蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒激肽释放酶i的别离纯化及其性质的研究j.生物化学与生物物理学报,1984,161:15-25.3韦传宝,陈建智.蛇毒蛋白组分的鉴定j.中国毒蛇学,1995:370.4angy,angsr,tsaiih.serineprteaseisfrsfdeinagkistrdnautusven:lning,sequeni