堆肥样品DNA提取

1、3堆肥样品DNA提取3.1堆肥样品的预处理DNA提取前对所有样品进行洗涤。取堆肥样品1.0g于5 ml离心管内，加入3ml TENP buffer(50mmol-L-1 Tris-HCl， 20mmol-L-1 EDTA，100mmol-L-1 NaCl，pH=10.0)，充分涡 旋2min，5000 r/min离心10min，沉淀再次洗涤；沉淀加入3mL 120mmolL-1的磷酸盐缓冲 溶液(pH=8.0)，充分涡旋混合，5000 r/min离心10min，洗涤直至上清液颜色较为澄清，沉 淀用于后续研究。DNA提取采用改进的蛋白酶K-CTAB法进行。1、 在洗涤好的样品中加入 1.5mLD

2、NA 提取液(100mmolL1 Tris-HC1，pH=8.0， 100mmolL-1 EDTA，pH=8.0，100mmolL-1 Na3PO4，1.4molL-1 NaCl，2% CTAB)，剧烈振荡 混匀后加入溶菌酶和蛋白酶K (均为10gL， 100mg-mL-1)o2、将混合好的样品置于37C、225 r/min摇床上摇动40min，加入200gL (10%) SDS， 65C水浴2h，每隔15-20min轻轻上下颠倒摇动。3、沉淀在室温6000r/min下离心10min，取上清，转移至新的5ml离心管中，再加入 0.5mLDNA提取液和50(10%)的SDS，65C水浴10min

3、，重复操作后，合并上清。4、在获得的上清液中加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，轻轻颠倒30min混合。 6000r/min下离心10min，吸取上清液转移至新的5mL离心管；同样操作3次，最大可能洗 去多糖、蛋白质的污染。在上清液中加入0.6倍体积异丙醇室温沉淀1h，11000r/min下离心 10min，弃上清。5、沉淀以1ml冰预冷的70%乙醇轻微振荡洗涤，4C下以13000r/min离心3min；沉淀 再以0.7ml冰预冷的无水乙醇再次轻微振荡洗涤，4C下以13000r/min离心2min。6、沉淀自然风干，加入250应TE缓冲液溶解DNAo 取 6应进行电泳走样，确认粗提 效果

4、。将粗提得到的DNA置于-20C保存。DNA的纯化根据本实验堆肥的特点，采用北京天根生化有限公司生产的普通DNA产物纯化试剂盒 纯化DNA，以期能够尽可能去除其中的各类杂质。由于堆肥中的杂质含量相比其他环境样 品，杂质含量更高。因此，如果DNA纯化的方法能够有效的去除堆肥样品DNA，则也一定会适用于其他样品。此试剂盒采用独特的离心吸附柱纯化DNA片段，具有快速多样高效等优点。操作步骤如下：1、柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500gL平衡液BL， 12000r/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。按照以 上方法提取到的DNA为粗提的DNA

5、，其中含有大量的其他杂质，如多糖、蛋白质、RNA， 最主要的是含有酶促反应抑制剂腐殖酸类物质，因此，粗提DNA溶液还需要经过纯化，才 能够用于PCR、DGGE等后续的分析。2、估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。将所得溶 液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12000r/min离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800gL，若样品 体积大于800gL可分批加入。3、向吸附柱CB2中加入700应漂洗液PW （使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000r/min离心1min，倒掉收集管中的

6、废液，将吸附柱CB2放入收集管中。4、向吸附柱CB2中加入500应漂洗液PW，12000r/min离心1min，倒掉废液。5、将吸附柱CB2放回收集管中，12000r/min离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。6、将吸附柱CB2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液 EB，室温放置2分钟。12000r/min离心2分钟收集DNA溶液。样品使用前于-20C保存。3.41%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯 化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝

7、胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻 力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁 移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA片段由于其泳动速度不同 而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。粗 提和纯化过程之后，可以通过此方法来观察所提取DNA的效果如何。其操作步骤为：1、准确称量琼脂糖干粉0.75g，置于锥形瓶中，向其中加入1ml 50XTAE，再加入50ml 超纯水，用玻璃棒搅拌均匀，置于电炉上加热至琼脂糖熔化。放置一边冷却，待温度降下来， 倒入带有梳齿的合适大小的模具中，厚度适中，室温冷却。2、待胶完全凝结后，小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内，加 样孔一侧靠近阴极。3、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。4、向DNA样中加入溴酚兰和SYBR Green I核酸染料，混匀后，加入样孔中。5、加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头DNA应向阳极（红色插头